氧化锌纳米颗粒与黄连挥发油纳米液对食源性致病菌的抑菌作用

*通信:

便我，伊朗伊斯兰阿扎德大学Quchan分校青年研究员和精英俱乐部，伊朗Quchan，电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

本研究以黄连为原料制备纳米液，对其体外抑菌活性进行了评价精油以及氧化锌纳米颗粒对不同细菌种类的抑制作用。采用水蒸馏法提取挥发油，用气相色谱-质谱法分析挥发油光谱法(气相)。琼脂盘扩散并采用微量稀释法对其进行抑菌活性研究。气相色谱-质谱(GC-MS)分析显示，香精油中含有16种化合物，占总成分的99.61%，其中百里酚(29.17%)和ρ-伞花烯(27.17%)为主要成分。阳性对照和含1000ppm、500 ppm和300ppm氧化锌NPs处理的抑菌带直径分别为28-33、18-37、17-32和16-29 mm。测定ZnO对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、entrica和e.c coli的最低抑菌浓度(MIC)分别为250、250、500和500 ppm。ZnO对上述细菌的最低杀菌浓度(MBC)分别为250、500、1000和500 ppm。蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌分别是最敏感和最不敏感的物种对抗纳米流体ZnO NPs提高了黄连精油的抑菌活性，并在食品包装、食品和制药系统等不同行业中显示出了良好的应用前景。

关键字

Nanofluid;Trachyspremum copticum;抗菌活性;氧化锌;纳米颗粒;气相

简介

许多食品本身易腐烂，因此在制备、储存和分发过程中需要防止其变质，以获得所需的保质期[1］．食物保护的基础是间歇性地寻找具有高营养质量和微生物稳定性的食物，它涉及控制变质和致病菌食源性微生物的生长/存活。提高食品的保质期具有重要的经济影响，因为它减少了由于变质造成的损失，并使产品能够进入遥远的新市场[2］．如今，在食品生产中过度使用合成抗微生物化合物作为添加剂是众所周知的，其中许多被怀疑具有残留毒性[3.］．由于消费者和法律当局的压力不断增加，食品工业倾向于减少化学防腐剂在产品中的使用，或完全不使用，或采用更天然的替代品来维持或延长产品的保质期[4］．几个精油(EOs) [4]和植物提取物[5]在食物保存方面有潜在的应用，可减少化学防腐剂的添加量和热处理的强度，从而使食物保存更自然，并具有更丰富的有机性质[3.］．

植物中发现的几种化合物;长期以来，它们一直被用作食品保鲜的天然剂，已被普遍接受。在这些天然化合物中，精油以及各种物种在食用和药用植物中，草药和香料因其抗菌潜力而被食品工业所考虑。的能力精油抑制某些的生长微生物是至关重要的，特别是当它表达对抗食源性病原体时[6]和植物油脂和提取物的抗菌活性已经形成了许多应用的基础，如在生的和加工的食品保存，药品，替代品医学自然疗法[7］．

Trachyspremum copticum是一种芳香草本植物，用于对抗真菌，细菌的药用价值。微繁殖可用于精油生产植物的大规模繁殖，从而避免自然资源的过度开发[8］．t . copticum属于家庭蜂科包括428个物种遍布世界各地。几项研究调查了香精油的化学成分t . copticum并专注于它们的抗菌活性[9］．最近,精油各种物种的t . copticum已对其传统的本土用途进行了筛选，并对其作为抗菌、抗真菌、抗氧化剂和其他天然产品的有希望的来源进行了深入研究[10］．

另一方面，纳米技术吸引了全球的关注，因为纳米颗粒(NPs)具有与散装等量物不同的独特性质。NPs的一个共同特征是其抗菌活性[11］．这项技术能够提供多种新颖的应用，从创新的织物化合物、食品加工、农业生产到复杂的医疗技术[12］．近年来，ZnO因其独特的光学、压电和磁性能而受到广泛关注[13］．此外，ZnO NPs具有潜在的影响食品和农业系统的许多方面，因为它具有抗菌功效，特别是随着越来越需要寻找替代方法来配制新型安全和具有成本效益的抗生素，以控制耐药病原体在食品加工环境中的传播[14］．据报道，纳米氧化锌具有非常好的安全性，当服用不同纳米尺寸的锌颗粒时，没有观察到毒性[15］．

本研究的目的是评估基于ZnO NPs和纳米液的抗菌活性t . copticum精油可以对抗典型的食源性病原体。

材料与方法

化学材料

采购了庆大霉素(Padtan teb，伊朗)、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)、Mueller Hinton琼脂(MHA) (Merck，德国)和Mueller Hinton肉汤(MHB) (Liofilchem，意大利)。

植物材料及精油

t . copticum精油(Gol Ghatre Toos，伊朗)购买并储存在4°C的灭菌小瓶中，直到使用为止。

气相色谱/质谱分析

GC-MS采用shimazu - qp2010se GC/MS，电离能70 eV, Restek-5毛细管柱(苯甲基硅氧烷，膜厚0.25 μm)，载气为氦气，流速0.9 ml/min，分流比1:20。在相同的色谱条件下，使用油后注入的正构烷烃的保留时间来确定保留指数。以正构烷烃为标准，采用Van Den Dool法测定各组分的保留指数。通过与文献报道的保留指数(RRI, HP-5)比较，并与Wiley和mass Finder 3文库的质谱或已发表的质谱进行比较，鉴定了这些化合物。通过对油样的定性和定量测定得到数据。

氧化锌NPs的制备

采用溶胶-凝胶法制备了ZnO NPs。为了制备ZnO NPs，在一个典型的实验中，0.2M的四氯化锌(ZnCl₄)在蒸馏水中加入甲醇，室温搅拌2小时(pH=5的白色溶液)，制备1M的氢氧化钠(NaOH)水溶液。然后，在高速搅拌(300转/分钟)下滴入白色溶液(缓慢1小时)到上述溶液中。在此条件下密封烧杯1小时，然后在220℃下加热5小时，制备ZnO NPs [16］．

纳米流体的制备包括t . copticum精油和氧化锌NPs

加入一定量的ZnO NPst . copticum精油和DMSO(比例3:1)以获得最终悬浮液，然后在25°C超声10分钟。ZnO NPs的终浓度分别为0、300、500和1000 ppm。

生物与接种条件

正宗的细菌纯培养物来自波斯型培养收藏(PTCC)。包括革兰氏阳性菌，蜡样芽胞杆菌(PTCC 1015),金黄色葡萄球菌(PTCC 1431)和革兰氏阴性细菌，沙门氏菌Entrica(PTCC 1709),大肠杆菌(PTCC 1399)。在进行任何抗菌试验之前，将它们置于4°C斜面琼脂上，并在新鲜的适当琼脂板上传代培养24小时。MHA用于细菌的激活，MHB用于MIC测定[17］．最后，将悬浮液调整到0.5麦克法兰标准浊度。细菌悬液标准浓度为1.5 × 10⁸CFU毫升^－1通过岛津UV-120-01分光光度计在600 nm处将光密度调至0.1 [18］．

抗菌试验

采用琼脂圆盘对所述纳米液进行抑菌活性测试扩散采用微量肉汤稀释法测定MIC和MBC [19］．

Disk-diffusion方法

对含氧化锌NPs和氧化锌NPs的纳米液进行了抑菌活性试验t . copticum精油使用盘扩散方法针对上述微生物［20.］．无菌滤纸盘(直径6毫米)放置在含有适当培养基(MHA)的板上，该培养基中含有试验生物(1.5 × 10⁸)．将15 μL含300ppm、500ppm和1000ppm NPs的纳米流体样品倒入圆盘上。这些板保持在4°C 15分钟，以允许最大限度的扩散。许多事件同时发生，包括干燥的圆盘从琼脂介质中吸收水分和溶解被测物质。测试材料从磁盘扩散到周围的介质根据物理法律控制扩散分子通过琼脂凝胶[21］．阴性对照采用DMSO，阳性对照采用庆大霉素[22］．然后将平板倒置，在37°C下孵育24小时，以获得生物体的最佳生长。具有抗菌性能的测试材料可以抑制圆盘周围介质中的微生物生长，从而产生一个明确的、明显的区域，定义为抑制区。然后，通过测量以毫米为单位的抑制区直径来确定测试剂的抗菌活性[23］．

最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)试验

采用微量稀释抑菌法测定了纳米流体的抑菌活性。在96孔微孔板上用肉汤微量稀释法测定MIC。所有测试均在MHB中进行。这些纳米液体被连续稀释以得到浓度:1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625,7.81,3.9,1.95 ppm。然后，在含有95 μl MHB和5 μl接种物(1.5 × 10⁶CFU毫升^－1)．微板在37°C下孵育24小时。对相应的测试生物体未显示明显生长的纳米流体进行稀释，视为MIC。为测定MBC，每孔取10 μl肉汤，在30℃或37℃的MHB中接种24 h。MBC定义为被接种微生物被完全杀死的纳米流体的最低浓度(99.99%)[24］．

统计分析

纳米流体处理包括ZnO NPs和t . copticum精油10个浓度，重复3次。数据采用Excel 2010进行分析，报告结果为X±SD。

结果

化学成分t . copticum精油

的化学成分t . copticum香精油概括在表1．根据所得数据，鉴定出16种化合物，占总油的99.61%。其主要成分为百里酚(29.17%)和ρ-伞花烯(27.17%)，其次为ɤ-松烯(19.27%)、苯酚(8.84%)、苯乙基乙醇(5.27%)、香芹醇(4.40%)、β-蒎烯(1.27%)和ρ-伞花烯α-醇(1.04%)。

表1。精油的化学成分t . copticumGC-MS分析。

圆盘扩散试验结果

阳性对照和含1000ppm、500 ppm和300ppm氧化锌NPs处理的抑菌带直径分别为28-33、18-37、17-32和16-29 mm。在细菌种类中，总结于表2，b的仙人掌最敏感(37毫米)和美国血清灵敏度最低(16毫米)。

表2。直径为mm的纳米流体抑制带，包括ZnO NPs和t . copticum精油。

MIC和MBC结果

综述了纳米流体的MIC值和MBC值表3这表明，所有的处理都能够阻止所有四种研究微生物的生长，包括革兰氏阳性细菌和阴性细菌。

表3。纳米液包括ZnO NPs和黄连菌的MIC和MBC精油(ppm)。

讨论

纳米技术在食品工业中的应用有不同的方面，纳米颗粒的应用是最好的例子之一。氧化锌、银和金纳米颗粒被广泛研究和应用于食品系统和特殊包装。这些纳米粒子可以直接用在载体上，比如精油因其抗氧化和抗菌活性而被广泛应用。有许多关于不同品种的抗菌活性的论文t . copticum．Usha等人的研究表明t . copticum具有抗菌活性假单胞菌spp．［25］．Murthy等人指出t . copticum提取物有效b的仙人掌48毫米的区域[26］．Hazzit等人研究表明，挥发油具有抗菌活性白念珠菌及幽门螺杆菌[27］．Kaure等人的抗菌活性t . copticum精油对抗Entrococcus粪而且金黄色葡萄球菌［28］．Malekinejad等人指出t . copticum挥发油抑菌MIC值为1.25 mg/ml物种［29］．

此外，对氧化锌的抗菌活性也进行了不同的研究。Mirhosseini等人。[30.]报道了氧化锌对单核细胞增多杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌而且b的仙人掌在苹果汁里。本研究为ZnO NPs作为抗菌剂在食品系统中的应用提供了新的思路医学可能有效抑制某些病原体。同样的结果，进行了减少大肠杆菌而且金黄色葡萄球菌在牛奶样品(30.］．

Tam等研究了水热法制备的ZnO NPs对细菌的抑菌活性大肠杆菌而且b . atrophaeus［31］．在另一项研究中，Jehad等人在食品系统中使用纳米氧化锌作为抗菌剂[32］．Saliani等研究表明，ZnO对大肠杆菌而且金黄色葡萄球菌抑菌效果随浓度的增加而增强，抑菌活性受温度和pH的影响[33］．

在本研究中，细菌物种包括克兰氏(+)和(-)细菌对纳米流体和精油表现出不同程度的敏感性，这可能是由于这两种微生物的化学组成和细胞壁结构不同所致。早先有报道称革兰氏阴性菌对外部试剂具有较高的耐药性，这归因于其外膜中存在的脂多糖，这使它们对抗生素、洗涤剂和亲水染料具有固有的耐药性。革兰氏阳性细菌的敏感性高于阴性细菌的原因可能是由于存在一层外肽聚糖层，这是一种无效的渗透屏障[34］．纳米颗粒具有更大的可用于相互作用的表面积，这比大尺寸的颗粒增强了杀菌效果，因此，它们赋予细胞毒性微生物［35］．研究表明，当氧化锌纳米颗粒处理细菌时，细菌的膜形态发生了变化，其渗透性显著增加，影响了细菌在质膜中的正常转运[36]，留下细菌细胞不能适当调节通过质膜的转运，导致细胞死亡[37］．

据观察，氧化锌纳米颗粒已经渗透到细菌内部，并通过与含磷和含硫化合物(如DNA)相互作用而造成损害。氧化锌往往与这类化合物具有很高的亲和性[38］．一般认为，纳米材料释放离子，离子与存在于细菌细胞表面的蛋白质的巯基(-SH)反应。这些蛋白质突出穿过细菌细胞膜，使营养物质通过细胞壁运输。纳米材料使蛋白质失活，降低膜的通透性，最终导致细胞死亡[39］．

结论

这是首次提供了包括ZnO NPs和纳米流体影响的数据t . copticum精油抗致病菌。结果表明，ZnO NPs与t . copticum精油。研究结果表明，有可能在食品工业中使用上述纳米流体作为天然抗菌剂来控制食源性病原体，并在食品系统中用作天然防腐剂来对抗众所周知的食源性疾病和食品腐败的致病因子。

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