研究
，卷:18(3)DOI: 10.37532/0972-768X.2020.18(3).313

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猕猴桃总酚、黄酮类化合物含量及体外自由基清除活性的生物测定

*通信:

sujeewa Krishanthi Hettihewa博士奥克兰大学化学科学学院，新西兰奥克兰西蒙兹街23号，邮编1142电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

本研究旨在成功地利用生物测定指导分离纯化酚类物质抗氧化剂富分数猕猴桃macrosperma水果。酚类化合物采用70%丙酮浸渍法提取，并采用Strata C18筒真空歧管固相萃取(SPE)进行初步纯化，从脱脂粗提物中去除更多的极性化合物，如糖和蛋白质，从而得到酸化的水馏分(F1)，而在酸化的甲醇馏分(F2)中获得中等极性化合物。采用Folin Ciocalteu法测定总酚含量，氯化铝法测定总黄酮含量。体外自由基清除活性采用2,2-二苯基-1-苦酰肼(DPPH)法进行评价。用高效液相法对提取物中的酚类化合物进行了鉴定色谱法耦合到二极管阵列检测器(HPLC-DAD)。总酚含量类黄酮含量酸性甲醇部分(F2)的自由基清除活性(分别为476.3±12.7 mg GAE/100 g DW、106.7±7.5 mg CAE/100 g DW和2.9±0.1 mmolTrolox当量/100 g DW)显著(p=0.05)高于酸性水部分(F1)(分别为363.2±18.9 mg GAE/100 g DW、46.2±0.7 mg CAE/100 g DW和2.0±1.0 mmolTrolox当量/100 g DW)。苯酚谱、自由基清除活性和HPLC-DAD指纹图谱表明，酸化甲醇馏分(F2)含有丰富的酚类物质类黄酮并且是最活跃的部分，经过进一步纯化以确定抗氧化剂。并对高性能液体进行了定性分析色谱法采用高效液相色谱法(HPLC)与二极管阵列检测器(DAD)相结合，成功地将生物测定引导分离技术应用于黄芩中富含酚类成分的纯化答:macrosperma猕猴桃。

关键字

生物测定引导分馏;分离;抗氧化剂;猕猴桃;多酚类物质

简介

许多植物和草药被认为具有抗氧化特性，并被广泛研究其对人体的有益作用健康根据动物和人类对环境和代谢因素产生的自由基的清除能力[1，2］．许多抗氧化化合物，如多酚、维生素C、E和A，存在于水果和蔬菜中，对它们的总抗氧化能力贡献最大[3.，4］．

猕猴桃是几种猕猴桃属木本葡萄品种的可食用浆果的共同名称。在猕猴桃属的几种物种中，Aactinidia macrosperma是一种非商业化的猕猴桃，橙色的果肉，小尺寸的果实，大种子，相对较厚，无毛的皮肤。这是一种著名的药用植物，在中国传统中药中被广泛使用医学［5-7］．

治疗潜力的研究药用植物验证植物材料的民族药理学用途，但也分离并专注于活性成分的表征[8-12］．因此，人们对酚的作用感兴趣抗氧化剂在人类健康促进了对各种植物性食品中活性酚成分的分离、分离和表征的研究[13］．各种色谱方法可用于分离(液相色谱、固相色谱)、分离{半制备高效液相色谱、开柱色谱、闪柱色谱、高速逆流色谱法(HSCCC)}，均有文献报道[14-19］．

虽然文献报道了一项关于大精香果实中酚类物质的分离、分离和鉴定的研究，但对大精香果实中酚类化合物如类黄酮由于多种化合物的共洗脱作用，其苷类化合物的特征不明显。因此，本研究的目的是利用生物测定指导分馏分离可能有效的抗氧化剂，在先前的研究中未发现的酚类化合物A.macrosperma生长在新西兰的水果。

材料与方法

植物材料取样

在新西兰特普克湾植物与食品研究果园采集了大精香达到生理成熟的果实。将有缺陷的果实丢弃，剩余的果实切成小块，冷冻干燥，-80℃保存。在提取之前，用杵将冻干的水果样品在砂浆中研磨，制备样品。

化学物质

福林- ciocalteu苯酚试剂、盐酸、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、对香豆酸、丁香酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素-3- o -葡萄糖苷、槲皮素、木犀草素、2,2-二苯基-2-吡基酰基(DPPH)、trolox购自美国圣路易斯Sigma公司。碳酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、甲酸和六水合铝来自西班牙的沙劳。没食子酸(ACROS，美国)，HPLC级甲醇，HPLC级乙腈，乙醇，甲醇，己烷和所有其他化学品均购自新西兰奥克兰ECP有限公司。

脱脂粗提物的制备A.macrosperma

采用所述方法提取冻干的磨碎水果样品[1］．为防止提取过程中酚类化合物的氧化，将冻干的水果样品(500 g)浸泡在70% q.丙酮(500 mL × 5)中，置于Scott Duran瓶中，在室温(23±2℃)下氮气吹洗，在暗处浸泡6 h。

采用真空歧管固相萃取(VSPE) -Strata®SPE C18生物测定指导分馏

由于脱脂粗提物可能含有糖、糖衍生物、酚类化合物和任何其他亲水化合物，这些化合物根据极性和酸度被分离成不同的馏分，使用Strata®C18 SPE筒(12 mL, SPE;(Phenomenex，新西兰)在真空流形上，根据[20.]对所选的分离溶剂作了一些修改(图1)．

C18 SPE容器用甲醇(20 mL)预处理，用2%甲酸在milliq -water (100 mL)中预处理。将冷冻干燥的脱脂粗提物(2.220 g / 3 ml 2%甲酸milliq -water)应用于SPE滤筒，2%甲酸milliq -water (100 ml)通过SPE滤筒，将糖和高极性化合物(如酚酸)洗脱到分数F1中。剩下的残留在药筒上的化合物用2%甲酸在甲醇(100 mL)中洗脱，给出分数F2。馏分F1和F2中的溶剂在35°C以下的真空旋转蒸发器上除去，进行冷冻干燥，然后在-80°C保存。这一过程在两个固相萃取筒上重复了几次，以获得足够的液-液萃取材料。

液液萃取

选择酸化甲醇馏分(F2)进行进一步的液-液萃取，如[1］．

样品在分离漏斗中，在乙酸乙酯和水之间进行多次液-液萃取，直到乙酸乙酯上层无色。分别收集含有中度极性化合物的组合上层乙酸乙酯层(黄色)和含有较多极性化合物的下层水层(红色)(分别为F3和F4)，然后在35°C以下的真空下使用旋转蒸发器进行浓缩。F3和F4冷冻干燥，-80℃保存。

酚类成分及自由基清除活性测定

Folin-Ciocalteu法测定总酚含量(TPC)类黄酮含量(TFO)的氯化铝比色法和自由基清除活性的DPPH法，部分(F1-F4)按照所述方法进行[1］．

分析型高性能液体色谱法耦合二极管阵列分光光度法(HPLC-DAD)分析

根据所描述的程序，定性地确定所有馏分中的酚分布[1］．

统计分析

所有获得的酚类特征和自由基清除活性的测量都进行了三次，结果以平均值±标准差表示。研究了分馏纯化步骤对总酚含量、总酚含量的影响类黄酮含量采用OriginPro8软件进行方差分析(ANOVA)。在OriginPro8中采用Tukeyss显著性差异检验进行两两比较。p= 0.05为差异显著。

结果与讨论

样品制备及提取

提取液的制备包括分解和均质样品，然后将感兴趣的化合物转移到合适的溶剂中。当处理像苯酚这样的活性化合物时，提取步骤尤其微妙。为了克服空气引起氧化的不利影响，将大精果冻干样品浸泡在提取溶剂中进行氮气吹扫的均质化。极性化合物如酚类化合物在活的植物中是空泡结合的细胞［21］．在冷冻干燥和均质过程中，液泡扭曲或破坏，允许在酚类化合物和其他分子(如蛋白质、多糖和核酸)之间形成强氢键。因此，植物材料的酚提取物总是不同种类的化学物质的混合物，这些化学物质可溶于所使用的溶剂体系[22］．因此，将粗提物与己烷分割的另一个步骤进行，以去除可能存在于水果基质中的类胡萝卜素和其他亲脂性化合物。分别收集富酚脱脂下水相和富类胡萝卜素上己烷相两种不混相。紫外可见光谱在250 nm-700 nm范围内显示，富酚相在280 nm处有一个强峰，富类胡萝卜素上相在400-600 nm处有几个峰，这与类胡萝卜素含量高一致。一些类胡萝卜素是通过与叶黄素(叶黄素和β-胡萝卜素的混合物)标准对照，在相同条件下在紫外可见分光光度计上进行鉴定的。最近有研究报道，大精果富含类胡萝卜素(叶黄素、β-胡萝卜素、玉米黄质、紫黄素)和叶绿素(叶绿素a和叶绿素b) [14］．

固相萃取技术在C18 Strata墨盒上的分馏

富酚脱脂粗提物(2.22 g)采用固相萃取技术，在真空歧管上的反相二氧化硅粘结C18 Strata墨盒上进行分馏。在一次运行中，从单个药筒中获得无色酸化水溶液(F1, 2.01 g)和红色酸化甲醇(F2, 0.21 g)馏分。这个过程在两个墨盒上重复了几次。采用HPLC-DAD法测定冻干粗提物、脱脂粗提物、F1和F2馏分的酚类成分及抗氧化能力。总酚含量类黄酮含量酸性甲醇馏分(F2)的自由基清除活性(分别为476.3±12.7 mg GAE/100 g DW、106.7±7.5 mg CAE/100 g DW和2.9±0.1 mmolTrolox当量/100 g DW)显著(p=0.05)高于酸性水馏分(F1)(分别为363.2±18.9 mg GAE/100 g DW、46.2±0.7 mg CAE/100 g DW和2.0±1.0 mmolTrolox当量/100 g DW)。

选择在两个固相萃取筒上重复运行后得到的活性最高的F2组分进行进一步的纯化和鉴定类黄酮在大精果中。馏分F2 (3g)在乙酸乙酯和水之间进行分割，得到馏分F3 (615 mg，单次循环)，其颜色为强烈的黄色，代表黄酮醇;F4 (2.31 g，单次循环)，其颜色为红色，代表黄烷-3-醇。总酚含量、总类黄酮含量、总黄烷醇含量和自由基清除活动(189.9±10.7毫克GAE DW / 100克,58.1±3.8毫克CAE / DW 100克,140.2±3.5毫克CAE / DW 100克、分别为1.9±0.1 mmolTrolox等价物/ 100 g DW)显示水的分数(F4)显著(p = 0.05)高于乙酸乙酯的比例(F3)(84.1±5.0毫克GAE DW / 100克,41.2±1.2毫克CAE / DW 100克,16.1±1.9毫克CAE / DW 100克、0.5±0.1 mmolTrolox当量/100 g DW)。水馏分(F4)具有较高的自由基清除活性，可能是由于F4中总黄烷醇含量较高。单体黄烷醇(儿茶素、表儿茶素)、二聚体黄烷醇、三聚体黄烷醇和聚合黄烷醇(原花青素)都很有名抗氧化剂［23，24］．

高效液相色谱- dad色谱图和360 nm的紫外-可见光谱显示，脱脂粗提物中的酚类化合物在C18墨盒上成功分离(图2 a-2c)．保留时间较短的化合物，如酚酸(最大吸收波长在300-320 nm之间)，用酸化水洗脱(分数F1) (图2 b)，保留时间较长的化合物，如黄酮醇及其苷类化合物(最大吸收波长在330-360 nm之间)，用酸化甲醇(分数F2)洗脱，如(图2 c)．

酚类化合物在反相模式下的洗脱顺序已在前面描述[25］．更多极性酚类化合物被洗脱在色谱的开始，顺序如下:羟基苯甲酸、黄烷-3-醇、羟基肉桂酸、香豆素、黄酮、二氢查耳酮、黄酮醇和黄酮。在同一类多酚中(a)保留时间随着多酚中羟基的增加而减少，(b)如果多酚中含有较少的极性取代基，如甲氧基，保留时间增加，(c)如果多酚化合物的化学结构包括糖，则多酚先于其苷元被洗脱。我们的观察结果与猕猴桃果汁酚类成分的研究结果一致。Hayward在SPE墨盒上使用了类似的分馏过程[26］．采用高效液相色谱- dad分析，将对香豆酸、原儿茶酸、丁香醛及香豆酸衍生物等强酸性酚类化合物洗脱到酸化水中，将儿茶素、表儿茶素、原花青素、二聚黄烷醇和四美黄烷醇、槲皮素葡萄糖苷、槲皮素李糖苷、山奈李糖苷和山奈李糖苷等弱酸性酚类化合物用酸化甲醇洗脱[26］．

F3和F4的HPLC-DAD色谱图见图3和图4．

结论

本研究旨在利用生物分析指导分离鉴定大精果中未发现的酚类抗氧化化合物。使用Strata C18筒的真空歧管固相萃取(SPE)用于初步纯化，以去除脱脂粗提物中更多的极性化合物，如糖和蛋白质，导致酸化的水馏分(F1)，而在酸化的甲醇馏分(F2)中获得中等极性化合物。苯酚谱、自由基清除活性和HPLC-DAD指纹图谱表明，酸化甲醇馏分(F2)含有丰富的酚类物质类黄酮并且是最活跃的部分，经过进一步纯化以确定抗氧化剂。

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