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互动的比较调查头孢尼西钠Multi-Spectroscopy牛转铁蛋白和牛血清白蛋白

*通信:

刘B重点实验室分析科技、化学与环境科学学院,河北大学,保定071002年,河北省,中国,电话:+ 86-312-5079385;传真:+ 86-312-5079525;电子邮件:lbs@hbu.edu.cn

文摘

头孢尼西钠的反应机制研究了牛血清白蛋白和牛转铁蛋白multi-spectroscopy方法。结果表明新配合物之间形成头孢尼西钠两种蛋白质,导致一个静态两种蛋白质的荧光猝灭。和两个系统的结合位点的数量大约等于1。在反应体系中,两种蛋白质的药物结合主要通过静电力。它还表明,两个系统的疏水性氨基酸残基周围的环境改变,和头孢尼西钠的主要结合位点都接近色氨酸残基。圆二色性光谱学显示两种蛋白质的二级结构发生了变化。希尔的系数的值表明有负面co-operativities后续的配体之间的相互作用和两种蛋白质。此外,有研究表明,牛血清白蛋白之间的绑定和头孢尼西钠强。然而,头孢尼西钠有较大影响牛转铁蛋白的微环境。头孢尼西钠和不同蛋白质之间的相互作用将有利于提取共同的特征,应用drug-proteins系统的独特的特点。

关键字

牛转铁蛋白;牛血清白蛋白;头孢尼西钠;Multi-spectroscopic方法;反应机理

介绍

头孢尼西钠(CFS),分子量为586.53,是广谱长效的第二代头孢菌素抗生素,并执行其抗菌活性通过抑制细菌细胞壁的合成。等感染后下呼吸道感染、尿路感染、败血症,皮肤和软组织感染、骨和关节感染,和手术感染预防可以用这种药物治疗(1]。CFS的分子式是C18H16N6NA2O8S3,其结构所示图1。

血清蛋白包含大量的白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白等。白蛋白和转铁蛋白有重要生理功能在存储和运输内源性代谢物和外源性药物分子(2]。此外,血清蛋白纯化容易。因此,被广泛应用于科学研究蛋白质之间的相互作用和药物进行调查。牛转铁蛋白的结构(BTF)与牛血清白蛋白(BSA)是不同的。转铁蛋白(TF)是一种单链蛋白质,含679个氨基酸残基。TF的血清浓度在活的有机体内是2.5毫克毫升⁻¹,分子量77 kDa。这种蛋白质分为两个叶(N和C),其中包含两个域组成一系列的α螺旋和β表(3]。特遣部队可以绑定两个域之间的铁离子每叶(4]。BSA是牛血清球蛋白,含有583个氨基酸残基,和分子量67 kDa [5]。BSA的空间结构包含三个结构域,每个域形式圆柱结构的相对等级的形式。和在汽缸疏水空腔形成6]。BTF和BSA都可以结合各种内源性和外源性物质,有利于实现运输药物在不动点和取向,使药物目标。这可以发挥的功效药物更有效。此外,小分子药物和蛋白质之间的相互作用直接影响吸收,代谢,药理学,毒理学和体内药物的功效,形成基础重新设计或修改药物分子。这是一个重要的方法理解蛋白质的生物效应。

目前,大多数研究protein-drug交互使用一种蛋白质模型蛋白质。然而,报道的比较研究两种蛋白质与药物的相互作用,是很少的。调查的交互药物与不同的蛋白质药物的功效更广泛的学习,理解的影响药物蛋白质的结构和功能,了解药物和蛋白质之间的相互作用的本质。之间的交互药物和不同的蛋白质将有利于提取共同的特征,运用独特的特点。在这个实验中,比较研究了CFS和BTF / BSA之间的交互进行,它有药物的临床应用的重要含义。

材料和方法

材料

试剂:慢性疲劳综合症(纯度> 98.5%)。BTF(纯度> 98.5%)和BSA(纯度> 99%)从Sigma-Aldrich购买。股票解决方案的BTF (1.0×10⁻⁵米),BSA (1.0×10⁻⁵米)和慢性疲劳综合症(1.0×10⁻³米)被储存在4°C。三(羟甲基)甲胺盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液(PH = 7.4)含有氯化钠(0.15米)。

方法

紫外可见吸收测量:的紫外可见实验进行了紫外可见分光光度计记录(uv - 265、日本岛津公司、日本)和1.0厘米石英细胞。1.0毫升Tris-HCl (pH = 7.40), 2.0(1.0×10毫升BTF或BSA的解决方案⁻⁵米)和不同浓度的CFS先后加入10毫升比色管。CFS的参考是不同浓度的解决方案。样品保存静态在298 K为30分钟。BTF的吸收光谱或BSA在不同浓度的CFS是记录在190 nm - 350 nm的波长范围。

荧光测量和同步荧光测量:所有荧光实验在日本岛津公司rf - 5301 pc斯派克fluoro-photometer配有SYC-15B过热水浴(南京Sangli电子设备工厂,南京,中国)。实验进行了路径长度1.0厘米细胞。在一个典型的荧光测量、1.0毫升Tris-HCl (pH = 7.40), 1.0(2.0×10毫升BTF或BSA的解决方案⁶米)和不同浓度的CFS先后加入10毫升比色管。样品被稀释了体积重蒸馏的水,混合彻底震动,并保持静态30分钟在不同温度(298、303和310 K)。BTF或BSA的激发波长为280 nm和295 nm,分别。激发和发射缝设置为5 nm。解决方案随后fluoro-photometer扫描和记录BTF或BSA的荧光强度。

同步荧光测定溶液中制备是详细的上面。我们记录的同步荧光光谱BTF / BSA-CFS系统当Δλ值之间的激发和发射波长稳定在15到60 nm,分别。

圆二色性测量:CD进行测量mos - 450 / SFM300圆二色性谱仪(法国的生物逻辑的造物九律),1.0 mm路径长度石英试管。1.0毫升Tris-HCl (pH = 7.40), 1.0(1.0×10毫升BSA或BTF的解决方案⁻⁵米)和不同浓度的CFS被添加到比色管先后10毫升,使蛋白质和药物的浓度比1:0,1:10,1:20,分别。样本稀释与水按比例缩小的体积,混合彻底震动,保持静态在298 K为30分钟。每个光谱被记录在波长200 nm和300 nm)和扫描速度之间的纳米秒¹。

结果与讨论

紫外可见吸收BTF / BSA-CFS系统的研究

吸收光谱测量是一个简单但有效的方法在确认复杂地层和结构变化7]。这种方法可以确定蛋白质和药物的相互作用机理。动态猝灭只有影响到激发态的荧光素,吸收光谱并没有改变。相反,静态淬火可以形成基态复合物,从而导致荧光团吸收光谱的变化(8]。紫外可见吸收光谱的BTF / BSA cfs系统所示图2。可以看出BTF或BSA有很强的吸收峰在212 nm和210 nm,和有一个弱的吸收峰在281 nm和280 nm。峰的强度在212 nm和210 nm减少,一个明显的吸收峰的红移的位置可以观察到随着CFS的增加。这可能归因于新CFS和BTF / BSA之间复杂的形成,这是一个静态猝灭过程。

BTF / BSA荧光的猝灭机理CFS

荧光猝灭是指荧光分子与溶剂分子之间的反应,降低荧光物质的荧光。由于其出色的灵敏度,选择性,再现性,简单的含义和广阔的理论基础,荧光光谱学是一个适当的方法,调查之间的相互作用药物和蛋白质(9]。λ的激发波长是固定的_前女友= 280 nm和λ_前女友分别为= 295海里。激发波长是固定的280纳米时,蛋白质中的色氨酸和酪氨酸残基是兴奋,而在295 nm波长,主要归因于排放峰值只色氨酸残基(10]。荧光猝灭实验进行的实验步骤“荧光测量”。BTF / BSA的荧光光谱CFS系统(λ_前女友= 280海里)所示图3,这表明定期BTF / BSA的荧光强度降低的慢性疲劳综合症。结果表明,BTF的固有荧光和BSA被CFS强烈淬火,之间有一个互动CFS和BTF或BSA。淬火的不同机制通常分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是基于蛋白质和药物之间的碰撞。静态猝灭是基于蛋白质和药物之间的相互作用发生在极化子的形成复杂的(11]。不同的淬火机制可以区分他们的不同对温度的依赖性。猝灭常数和绑定常量值的静态猝灭减少由于减少复杂的稳定造成温度的增加。相比之下,在动态猝灭,更高的温度会导致增加碰撞,所以预计猝灭常数和绑定常量值增加(12]。

为了研究淬火类型CFS和两个蛋白质之间,分析了荧光猝灭数据使用Stern-Volmer Eq。(2) (13]:

(2)

根据情商。(2)K_sv和K_问值可以获得。表1总结了的值K_sv和K_问在不同的温度下,显示的值K_sv在所有系统随温度增加而降低,表明可能的猝灭机制可能不是由动态碰撞,而是复杂的形成。此外,所有的值K_问是远远大于最大散射碰撞猝灭常数的值各种饮料(2.00×10吗¹⁰米¹年代¹),进一步表明反应是一个静态的过程(14]。这意味着系统BTF-CFS和BSACFS都生成一个新的荧光化合物。

表1:猝灭常数CFS和BTF / BSA在不同的温度下。

为静态猝灭,绑定常量(K_一个)和结合位点的数目(n)是通过以下方程(15]:

(3)

所示的结果表2。结果表明,n的值都是约等于1在不同的温度下,这意味着只有一个结合位点BTF或BSA CFS的存在。同时,减少绑定常数随着温度的增加,表明高温降低了BTF的亲和力/ BSA和慢性疲劳综合症,进一步表明淬火是一个静态的过程。这是按照上面的结论。此外,所示表2当λ,绑定常量_前女友= 280 nm大于λ时绑定常量_前女友= 295海里,在相同的温度下。这表明,酪氨酸残基与色氨酸残基都参与的互动BTF / BSA和慢性疲劳综合症。比较的数据表2,我们可以看到BSA-CFS体系的结合常数显著大于BTF-CFS系统,这表明,BSA和CFS强之间的绑定。这可能是由于从BTF BSA的结构是不同的。

表2:结合常数CFS和BTF / BSA在不同的温度下。

参与BTF的氨基酸残基的研究/ BSA-CFS系统

比较BTF / BSA的荧光猝灭兴奋在280 nm和295 nm),酪氨酸和色氨酸团体参与BTF / BSA-CFS系统可以评估16]。图4在CFS的存在表明,淬火BTF曲线或BSA在280 nm远远超出295海里。这一现象表明,色氨酸和酪氨酸残基之间的相互作用都是必不可少的CFS和BTF或BSA。

同步荧光光谱的研究BTF / BSA-CFS系统

同步荧光光谱学不仅能提供附近的微环境信息完全荧光团(17),但也可以确定的具体结合位点药物和蛋白质。因此,该方法常用于研究蛋白质和小分子配体之间的相互作用。同步荧光光谱学BTF或BSA可以提供酪氨酸和色氨酸残基的特征信息之间的波长间隔(Δλ)激发波长和发射波长是15或60 nm (18]。我们可以探索氨基酸残基的微环境的变化通过测量发射波长位移。如果有红移的最大发射,然后氨基酸残基的疏水性降低,极性增加,否则,极性氨基酸残基周围的减少和疏水性增加19]。可以看出图5,逐步减少BTF的同步荧光强度/ BSA-CFS系统观察在慢性疲劳综合症,这表明,CFS能解渴BTF的固有荧光/ BSA强烈。此外,BTF-CFS系统,Δλ15 nm或60 nm时,一个明显的最大发射波长红移是观察在慢性疲劳综合症,这表明色氨酸和酪氨酸残基的极性增加。BSA-CFS系统,Δλ15海里时,没有观察重大转变。然而,Δλ60 nm时,一个轻微的红移的最大排放对CFS的观察。这表明的CFS没有影响BSA的酪氨酸残基的极性,使色氨酸残基的疏水性和极性的增加而减少。结果表明,BTF和BSA的构象变化与慢性疲劳综合症,但变化是不同的。慢性疲劳综合症的影响对BSA BTF大于。

为了进一步确认具体的CFS BTF / BSA的结合位点,同步荧光猝灭的比率(R_SFQ)Δλ= 15 nm和60 nm比较。R_SFQ表达同步荧光强度的下降百分比。我们可以获得R_SFQ由方程:R_SFQ= 1−/ F₀(20.]。相应的比例R_SFQ说明在图6从今以后图6可以看出R_SFQΔλ= 60 nm大于相应的Δλtwosystems = 15海里,显示,CFS BTF / BSA的结合位点是接近色氨酸残基。

类型的相互作用力BTF / BSA-CFS系统

小分子和大分子之间的相互作用力量,包括四种类型的交互,即氢键、静电力、范德华相互作用和疏水相互作用[21]。一般来说,热力学参数(ΔH焓变化,熵变ΔS和自由能源改变ΔG)为了进一步描述分析了药物和蛋白质之间的代理部队,因为这些是主要的证据提出的绑定模式(22]。在研究温度效应是非常小所以焓变化的交互(ΔH)可以采取常数23]。热力学参数可以计算出基于Eq。(4), (5), (6)24]。

(4)

(5)

(6)

中列出的热力学参数表3。我们可以看到表3的负值ΔG确认之间的自发反应BTF / BSA和慢性疲劳综合症。ΔH的负价值和积极的价值ΔS表示,慢性疲劳综合症主要是绑定到BTF / BSA的静电吸引(25]。比较ΔG的值在两个系统中,它可以知道ΔG BSA-CFS系统是小于BTF-CFS系统,表明BSA-CFS系统的自发反应的程度大于BTF-CFS系统。所以,BSA-CFS系统的反应更容易发生。因此,绑定常量BSA-CFS系统大。

表3:BTF的热力学参数/ BSA-CFS系统在不同的温度下。

CD光谱BTF / BSA-CFS系统

BTF的CD光谱/ BSA-CFS系统pH值7.4所示图7。明显的从图7、纯BTF和BSA的CD光谱表明,BSA紫外线地区表现出两个负峰值在208和222海里,α-helix结构特征的蛋白质(26]。一个合理的解释是,负峰值在208 nm和222 nm)都是由n→π*跃迁α-helix(肽键的27]。的实验研究(BTF) / (CFS)的摩尔比率1:0,1:10,1:20。和摩尔比率(BSA) / (CFS)也1:0,1:10,1:20。在CFS的存在,增加负摩尔椭圆率的观察信号在208和222海里,这表明一个增强α-helical BTF的内容与CFS / BSA在绑定28]。为了进一步证明α-helical BTF的内容的改变/ BSA,螺旋性的比例可以计算使用以下方程(29日]:

(7)

(8)

计算结果表明,有一个纯BTFα-helix含量从14.34%增加到15.97%和17.54% BTF-CFS复合物。有增加α-helix内容从纯粹的43.64% BSA BSA-CFS复合物到45.77%和48.31%。这表明BTF / BSA的二级结构已经发生了变化。和BSA的二级结构是超过BTF打扰。然而,CD光谱的形状之间的相似性与BTF / BSA的存在和缺乏CFS在所有互动系统建议BTF的结构/ BSA仍主要α-helical [30.]。

希尔的BTF / BSA-CFS系统的系数

在生物化学,配位体分子的绑定在一个站点与高分子通常影响其他配体分子与高分子的亲和力。这就是所谓的合作绑定。分为积极co-operativity, - co-operativity non-cooperativity根据促进或抑制其他配体分子的亲和力。希尔的系数提供了一种量化这种影响和图形的基础上计算下列方程(31日]:

(9)

Y是部分绑定饱和度,nH是希尔的系数。希尔系数> 1的值表明积极的协同,值< 1显示- co-operativity和值= 1表示一个非合作的反应。荧光测量:

(10)

(11)

1 /问_米是一块1 / Q的拦截vs.1 / [L]。我们可以看到表4的值,n_H< 1,这表明有负面互动的合作CFS BTF / BSA。这表明,后续的配体结合BTF / BSA的能力下降与以前的CFS BTF / BSA逐渐有约束力。此外,n_H与增加温度呈负相关,也是减少的一个原因吗K_一个随着温度(32]。

表4:希尔的BTF / BSA-CFS系统系数在不同的温度下。

结论

摘要传统的荧光猝灭法,同步荧光光谱,UV-V吸收光谱学和圆二色性光谱学被用来研究淬火机理、热力学参数的影响药物对蛋白质的构象和合作绑定在两个不同的系统。结果表明,淬火的BTF / BSA-CFS系统是静态猝灭机制。之间有一个紧密绑定BSA和慢性疲劳综合症,从而BSA-CFS系统更大的结合常数。然而,同步荧光光谱学证明了CFS BTF的微环境的影响更大了。这些结果是由于BTF和BSA的不同结构。结果表明,两种蛋白质可以作为药物载体,但BSA可能有较高的能力提供慢性疲劳综合症。从这些实验中获得的有价值的信息将帮助研究人员了解药的途径,并有实际含义头孢菌素药物的临床应用。

承认

作者欣然承认中国国家科学基金会的资金支持(排名21375032)。

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