研究

，卷:19(9)

• 查看PDF
• 下载

花青素颜色系统有祖先吗?物理化学能告诉我们什么

*通信:

冰镇F新里斯本大学化学系，卡帕里卡，电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

花青素是被子植物颜色的基础，苔藓和蕨类植物中3-脱氧花青素和吞噬红素起同样的作用，苔类中auronidins起决定颜色的作用。这些世系祖先的分离发生在陆地植物进化的不同时期，因此，我们的论文是化学的进化伴随植物进化的颜色系统。作为简单花青素的代表化合物，花青素-3- o -葡萄糖苷(kuromanin)的色系被完全表征为止流。这种类型的花青素如果没有分子内或分子间的相互作用，与金属络合或超分子结构(如Commelina communis)，就不能赋予植物显著的颜色。将该花青素的颜色体系与3-脱氧花青素的颜色体系和马尾草苷元马尾草苷A的颜色体系进行比较。这三个体系遵循相同的化学反应顺序，但各自的热力学和动力学有很大的不同。

关键字

花青素;3-Deoxyanthocyanins;Auronidins;植物的进化

简介

我们在这项工作中提出的论点是，赋予被子植物颜色的花青素系统，由不同的分子组成，以前被地苔、苔藓和蕨类植物使用。我们指的是花青素系统，黄酮阳离子，醌类碱，半穗酮，顺式和反式查尔酮，以及它们相互转化的化学反应。对苔藓的起源估计在寒武纪至奥陶纪1，而对苔类的起源估计在奥陶纪至早泥盆世2,3，但几个相互矛盾的假设阻碍了对这些类群的年龄估计。蕨类植物起源于泥盆纪早中期，被子植物起源于下白垩世，可能更早。这些植物使用的颜色系统是基于呋喃黄酮阳离子(地苔类)、3-脱氧花青素和藻红素(苔藓和蕨类)和花青素(被子植物)。花青素的颜色系统与其他两种颜色系统相比具有独特的通用性[1］.

颜色在自然界中无处不在，花青素是植物王国中存在的最大一类水溶性化合物，负责植物的一系列颜色，从橙红色到紫蓝色。花青素是花青素的糖基化形式，通常以3-糖苷或3,5-二糖苷的形式出现，图1。不同类型的单糖(如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖)和双糖(如芦丁糖、桑布二糖和槐糖)可以附着在黄酮核上，这些糖也可以与肉桂酸(如咖啡酸、香豆酸、阿魏酸和辛酸)或脂肪酸(如乙酸、苹果酸、草酸和琥珀酸)酰化。

与花青素相关的有苔藓和蕨类植物中的3-脱氧花青素，泥炭苔藓中发现的sphanoruins，以及auronidins(呋喃黄酮衍生物)，Andersen和Davies质疑“auronidins可能有助于地苔在陆地极端环境中生存的显著能力，他们的发现对第一批陆地植物可能的色素状态提出了质疑。”

近二十年来，我们一直致力于天然花青素和3-脱氧花青素以及相关合成黄酮化合物的动力学和热力学研究。在这些研究之后，我们研究了呋喃黄酮化合物的动力学和热力学，以及Andersen和Davies报道的auronidin的配元riccionidin A。在这项工作中，我们讨论了植物使用的三种颜色系统:auronidins, 3-脱氧花青素和花青素，给出了一些物理化学论据，以考虑这些植物家族中的三种颜色系统伴随它们的进化。我们中的一些人已经报告了这三个系统之间的一些相似点和不同点。在这项工作中，我们主要关注与其他两种相比，花青素颜色系统的更高潜力。新报道的基于反pH跳跃和停止流动的理论语料库，用于表征malvidin-3- o -葡萄糖苷(oenin)，并应用于cyanidin-3- o -葡萄糖苷(kuromanin)。

结果与讨论

花青素的颜色系统青花素-3- o -葡萄糖苷(Kuromanin)的情况。黑素的颜色体系如图2所示。

黄离子是底物物种在pH值≤1。当pH值上升到中等酸性溶液(这里由pH值直接跳跃定义)时，其他物种按下列顺序形成:醌类碱，半穗酮，顺-查尔酮和跨查尔酮。在较高的pH值下，阴离子或多阴离子与中性类似物种取决于pH值

pH值直接上升后的平衡动力学过程很能说明问题。质子转移是迄今为止动力学中较快的步骤，发生在停止流动的混合时间内(几毫秒)。在以下步骤中，AH+和A表现为单个物种其比值为[A]/[AH+]=Ka/[H+]。下一步是通过AH+的水合作用(min)形成半iketal, B，然后开环得到顺式查尔酮，Cc， (ms/s)。醌类碱在酸性介质中不能打开是一项突破性的发现，对理解花青素及其相关化合物至关重要。花青素中反式查尔酮(Ct)的异构化在数小时内发生。当体系平衡在中酸性pH值时，加入酸达到pH≤1 (pH值反向跳跃)恢复黄酮阳离子。这是应用反pH值跳跃，然后停止流动的基础[2］.

花青素的热力学行为可以用an表示能源这两种表示形式都可以推广到在中性和碱性溶液中通过羟取代基的去质子化而得到的阴离子形式。然而,能源当存在阴离子时，能级图变得更加复杂和难以解释物种包括在内，因此通常用于描述方案3第一行的平衡。

花青素多态。

研究了花青素的平衡。

延伸到更高的pH值

这个复杂的体系可以被简化为由式9和式12给出的聚质子酸。

考虑到黄离子与共轭形式CB和CB-的平衡状态，这个复杂的体系可以简化，从而可以简化数学处理。

在花青素和其他许多黄酮中衍生出多种状态物种异构化是迄今为止最慢的动力学过程，伪平衡可以定义为反式查尔酮显著形成之前获得的瞬态。

实现Scheme中报告的平衡常数的最准确方法是基于反pH跳变(定义为在较高pH值下，将酸添加到pH≤1的平衡溶液或伪平衡溶液)20，由停止流动监测21在一个典型的反pH跳的痕迹显示。观察到三个振幅。第一个是由于黄酮离子吸收，这是由于在停止流动的混合时间内，所有醌类碱(中性和阴离子)与一些黄酮在pH值跳跃之前处于平衡状态(对于较低的pH值)。由于pH≤1时体系的变化导致水化/脱水反应比互变异构反应更快，因此，半iketal转化为黄烷阳离子是反应速度较快的原因。最后一个振幅对应于顺式查尔酮经半iketal形成更多的黄酮阳离子。这些振幅归一化的单位直接给出这些摩尔分数的分布物种在伪平衡。利用实验数据计算了所报道的平衡常数。一旦得到这些常数，能源考虑到吉布斯自由能、R完美气体常数、T绝对温度(开尔文度)和K化学反应的平衡常数，可以构造能级图[3.］.

Ct和Ct-的摩尔分数是通过标准分光光度计逆pH值跳跃来计算的。扩展到从不同pH值开始的一系列pH跳跃，计算了Ct的摩尔分数分布，并重新计算了AH+、a + a -、B+B-和Cc+Cc-的摩尔分数，以贴现Ct和Ct-的摩尔分数。表1为黑罗曼素的平衡常数以及各摩尔分数的分布物种在平衡状态下。应该强调的是关于阴离子的常数物种由于误差的传播有更高的不确定性法律(取决于中性物种的平衡常数)以及由于较简单的花青素在较高pH值下的不稳定性，特别是确定Ct的摩尔分数。

花青素赋予颜色的限制

花青素位于液泡中。液泡的pH值可能变化很大，但常观察到pH值约为5而液泡的pH值可为低在柑橘类水果中为2.0，在某些花卉中为7.7或更高在花青素中着色物种是黄酮阳离子和喹诺基。在简单的花青素，如malvidin-3- o -葡萄糖苷(Oenin)和cyanidin-3- o -葡萄糖苷(kuromanin)的情况下，在平衡状态下的颜色仅在黄酮阳离子中观察到低在pH值和中等酸性pH值下，醌类碱的摩尔分数很低。因此，无论是黄酮阳离子还是喹诺酮碱都不能在中酸性溶液中产生显著的颜色。奇怪的是，在接近中性的pH值下，阴离子醌类碱的颜色是可接近的，但在这些pH值下，这些花青素是不稳定的。值得注意的是，尽管科学界普遍接受这一观点，但与酒苷所观察到的情况相反，黑罗宁的电离的醌类碱(A-)似乎并不能使溶液呈现蓝色。

为了更详细地研究这一现象，通过停止流动进行了一系列pH值从pH =1到更高pH值(直到pH =12)的直接跳跃，以计算四种脱质子化反应。该技术允许快速(pH值跳跃后约10毫秒)获取吸收光谱，这对于研究酸碱平衡是必要的，而不会干扰水合作用和随后导致褪色的反应。在四种不同波长下的吸光度随pH值的变化图，用于从黄酮阳离子中获得醌类碱及其电离形式的各自pKa值。

使用该方法得到以下值:pKa1=4.0;pKa2 = 6.5;pKa3 = 10.0;pKa4=12.2, pKa1=3.9;pKa2 = 6.3;pKa3 = 8.4。虽然前两者相当相似，但形成二电离喹啉基的pKa3对黑罗曼宁来说要高得多。通过将黄酮阳离子和所有醌类碱的ph依赖的摩尔分数分布与各自的光谱数据相结合，可以得到这五种化合物的光谱物种通过谱分解。

结果清楚地表明，A-的光谱不能解释蓝色(与红移的酒酸的A-形成对比)，这种颜色只能由A2-和A3-表示，它们只在非常基本的pH值下出现。由于这些条件在生物系统中似乎不可行，因此结果表明，当与金属阳离子络合或通过其他机制将第三和第四个pKa移至较低的值时，黑素只能表达蓝色。

为了克服简单的花青素赋予颜色的限制，《自然》使用了不同的策略。其中研究最多的是色素辅沉，罗宾逊将其定义为由无色化合物(如氨基酸、糖和类黄酮)引起的花青素吸收光谱的改变。如酰基化花青素中观察到的那样，共色素沉着可能是分子间和/或分子内的。《自然》杂志使用的其他策略是自结合和金属络合。总结，色彩的稳定物种通常由几种非共价相互作用驱动，如氢键、范德华、金属配体相互作用和疏水驱动的结合。

这几个人之间相互转换的程度之大物种花青素的多种状态。在pH值直接上升(例如pH=6)后，醌类碱就形成了，其速率比停止流动的混合时间还要快，这就需要其他技术来观察，如温度跳跃15或闪光光解35。在连续的动力学步骤中，AH+和A处于平衡状态，各自的比值等于[A]/[AH+]=Ka/[H+]。AH+和A走向平衡的消失是一个双指数过程，第2步和第3步，分别表现出非常不同的寿命、分钟和小时。由于在pH值直接跳跃时，互变异构反应比水化反应快，因此第二步受最后一步控制。

说明第二步的表达式以一种直接的方式实现，考虑到物种一边是AH+和A，另一边是B和Cc在水化过程中处于快速平衡状态。

和分别是AH+与A平衡时的摩尔分数和B与Cc平衡时的摩尔分数。在第二步结束时，系统达到伪平衡。第三步受异构化控制，由于第二步和第三步的速率不同，可以认为AH+、A、B和Cc处于平衡状态。

Cc在伪平衡时的摩尔分数。从花青素体系的热力学和动力学方面可以得出一些结论。在平衡状态下，红色、粉色和蓝色是潜在的，但植物应该使用一些策略来表达这些颜色;正如名古屋研究小组报道的那样，酰基化花青素和超分子结构中的分子内和/或分子间辅色素沉着，如给予Commelina communis蓝色的那种结构。3-脱氧花青素的显色体系遵循相同的多态物种，但异构化并不是达到平衡的最慢的动力学步骤[4］.

在pH值的直接跳跃中，AH+/ a转化为Ct是通过伪一级动力学的单步进行的。考虑AH+与A (X)处于快速平衡，B与Cc (Y)处于快速平衡，产生Ct (Z)，这一机制相当于涉及3的可逆动力学方案物种是必需的。对于木犀草素及相关化合物，在相同的最终pH值下，其逆pH跳变的速率常数与正pH跳变的速率常数相等，且B和Cc难以捉摸物种在静止状态下以不可测量的浓度出现。但是，A和Ct的摩尔分数可以从钟形曲线的数据中计算出来，由Ka/K 'a和KhKtKi/K 'a的比值得到各自的摩尔分数分布。

下一节将讨论对颜色出现和消失的动力学反应之间的比较。3-脱氧花青素不能产生蓝色。花青素与3-脱氧花青素颜色体系的比较。与木犀草素相比，花青素的苷元——花青素的化学结构只在第3位的羟基上有所不同。值得注意的是，花青素和其他花青素一样，在中等酸性溶液中非常不稳定39，而在苔藓中发现的木犀草素40和藻红素A9则相对稳定。这说明羟基不是由于花青素的稳定性而被引入到花青素的第3位。原因是这种取代产生了一个红色的黄酮阳离子，一个粉红色的喹诺酮碱和一个蓝色或蓝色(取决于花青素)阴离子喹诺酮碱。花青素的不稳定性通过3位糖基化得到3- o型花青素(花青素)。第5位的糖基化对稳定性没有太大影响。

木犀草素的喹诺基为红色，阴离子喹诺基为橙色。没有蓝色。从进化的角度来看，蓝色似乎是最苛刻的。Yoshida等人的优秀评论给出了用于表达这种颜色的结构的概述乐动体育在线分子间和分子内共色素沉着(在酰基化花青素中)和金属络合是获得蓝色的策略。最复杂的结构(从化学角度来看)是金属花青素，例如赋予Commelina communis颜色的金属花青素(图4)。在这个超分子中，2种金属，6种花青素和6种黄酮以两种平行的方式组织[5］.

草图由吉田久美教授提供。构建块以自底向上的方式自关联产生超分子。这两种体系的另一个区别是化学物质的摩尔分数分布取决于pH值物种出现在平衡和相应的动力学状态。当植物需要增加或减少颜色以保护免受环境影响时，花青素有一个无色半iketal(与顺式查尔酮快速平衡)的库，通过水化/脱水反应快速增加或减少颜色的量。相比之下，3-脱氧花青素在着色之间具有平衡物种黄酮阳离子，醌基和反式查尔酮。颜色的出现/消失是通过AH+/A和Ct的相互转换发生的，并遵循动力学曲线，而在花青素中则是更快的水化反应控制。

Auronidin-2 ' -新橙皮苷是由Davies和Andersen10从地苔Marchantia polymorpha中提取的，他们将这些分子命名为auronidins。近年来，我们研究了所谓的呋喃黄酮化合物的热力学和动力学，Chakravarty用这个术语来表示这些化合物(图5)

我们证实了在4 ' -羟基呋喃黄酮中，4 '，7-二羟基呋喃黄酮和马尾草苷A中，马尾草苷-2 ' -新橙皮苷苷元遵循相同的多态物种花青素和3-脱氧花青素。Riccionidin A在几种地苔中被鉴定出来，例如在南极的变异头齐菌(Cephaloziella varians)中，对UV-B辐射的突然增加作出反应，Ricciocarpos natans的离体培养中42，以及Anacardiaceae的rus javanica的不定根培养中(图6)。

riccionidin A最有趣的特点是其在黄烷阳离子中反式查尔酮的转化速度极慢。在100度的醋酸和HCl气体中^ºC转换需要超过11天，在pH=5.0的甲醇:水(1:1)在45^ºC，反应同样非常缓慢，但是酸度不足以产生黄酮阳离子。

有可能识别物种AH+， A, B, Cc和Ct在分解前通过HPLC/MS13，证实了其多态物种与花青素和3-脱氧花青素相同。此外，这三个家族的降解产物似乎相似。

花青素的降解过程始于酮烯醇平衡，包括半花酮类和查尔酮类的C3-OH。的形成物种C3-OH(花青素)的糖基化阻止了酮烯平衡，增强了分子的稳定性。对于花青素，其降解过程始于糖基键的断裂，在C3处释放羟基。从那一点开始，这个系统就像一个花青素。此外，3位OH基团的缺失(3-脱氧花青素)也增强了分子的稳定性，尽管可以检测到一些降解产物作为次要成分。从这个意义上说，形成的跨硫醇是非常稳定的，它通过氧化二聚化或c环裂变的降解远小于花青素。

Auronidins也表现出类似的降解行为。在这种情况下，反式查尔酮比以前更不稳定，可以通过氧化偶联降解，是这样的物种HPLC/MS检测主要降解产物。此外，呋喃环也可以进行开环，使c环裂变降解作为次要产物。上面显示的数据和我们之前报告的一些数据13证明了蛇毒杆菌素a遵循完全相同的多状态物种以及花青素和3-脱氧花青素的化学反应。在riccionidin中可用的颜色。这些照片是在pH值直接上升后立即拍摄的。只有在植物中没有的极高pH值时才会呈现蓝色[6］.

如上所述，在蓖麻毒素以及Davies和Andersen所报道的其糖苷形式中，黄酮阳离子是淡黄色的，喹诺基是红色的。其稳定性受pH值<4和反应速率常数的限制物种非常慢。在较高的pH值下，蓖麻毒素。A的降解过程与花青素和3-脱氧花青素相似。从这个意义上说，这三个家族的化合物产生相同的产物，根据查尔酮物种的相对稳定性，它们的延伸程度不同。所有这三个家族在酸性条件下都是稳定的，但当pH增加时，也就是查尔酮的摩尔分数增加时，降解产物在大多数情况下开始通过氧化偶联或c环裂变降解出现。作为未来工作的一个建议，验证auronidins是否能够通过共色素沉淀形成关联或产生金属配合物将是有趣的，因为环a中有一种儿茶酚可以与金属连接。呋喃环阻止了糖在3号位置的附着，糖基化发生在该位置。花青素，如合成的黄酮类化合物，在2 '位上带有一个羟基，能够从单阴离子查尔酮中形成黄酮。未来研究的另一个观点是将Davies和Andersen auronidin与riccionidin的结果进行比较。

直接pH值跳跃是通过混合股票黑罗宁0.1 M HCl溶液(3 × 10⁵M)与含有NaOH 0.1M的溶液和使用停止流在所需最终pH值的Theorell和Stenhagen通用缓冲液(S × 20，应用光物理;(英国萨里)光谱仪，配备了PDA/UV光电二极管阵列探测器。直接的pH值跳跃也进行了添加一小部分的浓缩股票将花青素溶液(pH=1)加入3ml比色皿中，加入足够的氢氧化钠以中和股票光谱测量是在20±1的恒定温度下使用milliq水进行的^ºC使用Varian- cary 100 Bio或Varian。Cary 5000分光光度计。通过停止流动(拟平衡溶液)和普通分光光度计，在不同pH值的花青素/花青素平衡溶液中加入足够的HCl使pH=1，进行反pH跳变。用Radiometer Copenhagen PHM240 pH/离子计测量溶液的最终pH值。

结论

的物理化学蓖麻毒素A和3-脱氧花青素的比较结果清楚地表明前者的用途远不如后者。花青素本身具有表达颜色的先天限制，具有完整的颜色托盘，可以通过分子内和分子间的共色素沉着、与金属的协调以及所有这些作用的组合来表达这些颜色，就像在金属花青素的情况下一样。毫无疑问，颜色系统也有一个进化从auronidins, 3-脱氧花青素和花青素来看进化似乎是平行的进化各自的植物。我们想知道这项工作中报道的结果是否有助于目前关于苔藓和苔类之间以及该类群和维管植物之间差异的系统发育假设的讨论。

参考文献

1. 现代玫瑰中的花青素:与颜色范围相关的化学和比色学特征。实验学报，1993;44(11):1725-1734。
2. 王丽娟，王丽娟，等。黄酮化合物的化学及应用:几种颜色。化学学报，2012;41(2):869-908。
3. 张志刚，王晓明，王志刚，等。苦苣苔科花色信号的化学基础:花青素替代途径的影响。前沿植物科学2020。
4. Rudall PJ。彩色球果:花朵的颜色最初是如何进化的?实验学报，2020;71(3):759-767。
5. 王晓明，李志强，李志强，等。野生和栽培蓝莓对一种侵入性食果害虫的不同敏感性。化学学报，2019;45(3):286-297。
6. Streisfeld MA, Rausher MD.改变花青素基因表达的反式调节控制有助于自适应花的颜色进化在Mimulus aurantiacus。分子生物学学报，2009;26(2):433-444。