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Hepato-preventive活动针对CCl4-Induced损伤小鼠的骆驼奶

*通信:

哈米德Gargouri M和H实验室动物生态生理学、科学教师斯法克斯大学3038斯法克斯,突尼斯
电话:+ 216 74 241 888;传真:+ 216 74 246 217;电子邮件: (电子邮件保护)

文摘

本研究旨在评估的潜在影响小鼠暴露于亚兰单剂量骆驼的肝组织和有效的预防效果牛奶强饲法(CM)口服治疗。此外,亚兰是由intra-peretonial注入14天。亚兰引起的脂质过氧化作用的增加和减少超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活动和肝脏谷胱甘肽的水平。此外,亚兰引起了著名的崛起肝水平标记(AST、ALT、ALP、LDH、E¤gt), TG, TC, LDL-Ch但HDL-Ch水平降低。相比之下,没有这样的伤害或生物化学变化的形式被发现在老鼠对待骆驼牛奶针对通常在CCl4-treated动物观察到的变化。这些发现有力地证明了骆驼的有利影响牛奶清楚地显示通过减少亚兰诱导相关的损害赔偿和氧化应激。

关键字

四氯化碳;骆驼奶;Hepatoprotection;组织病理学研究;老鼠;氧化应激

缩写

AST:天冬氨酸氨基转移酶;ALT:丙氨酸氨基转移酶;高山:碱性磷酸酶;猫:过氧化氢酶;CM:骆驼奶;ɤgt:ɤ谷酰基转肽酶;GPx:谷胱甘肽过氧化物酶;谷胱甘肽:减少谷胱甘肽;HDL-Ch:高密度脂蛋白胆固醇;LDH:乳酸脱氢酶; LDL-Ch:低密度脂蛋白胆固醇;ROS:活性氧;SOD:超氧化物歧化酶;TBARS:硫代巴比土酸活性物质;T-Ch:总胆固醇;TG:甘油三酸酯

介绍

肝脏疾病仍是对公众的一个主要威胁健康和一个世界性的问题1]。世界健康组织估计,全球46%的疾病和死亡率的59%是由于慢性疾病(2)和管理肝疾病仍然是现代的一个严重问题医学因为后者几乎没有提供减轻肝脏疾病(3]。肝脏是主要的器官,负责一些代谢功能。它是负责许多重要的生命器官功能,包括食物消化、糖原存储、控制代谢,药物解毒和激素生产(4]。因为肝脏是对生命至关重要,故障或失败的器官往往导致高发病率和死亡率。各种物质是导致肝损伤,其中一个是四氯化碳(三地₄),这是一个众所周知的肝毒素(5]。体内,三地₄分解和剧毒三氯甲基三氯甲基过氧化氢自由基的细胞色素P450酶(6)造成损害肝细胞和充当生化改变,血液参数(7]。CCl的肝毒素的效果₄部分由抗氧化化合物包括规避维生素non-enzymatic C和E抗氧化剂(8和水飞蓟素9]。CCl诱导的肝损伤₄已经极大地用作模型调查hepato-protective代理(8- - - - - -11]。当肝脏受伤,它与著名的化学治疗药物仍然是有限的(12]。因此,兴趣替代药物的好处作为肝脏疾病的治疗已经出现。丰富的骆驼牛奶在肽和蛋白质表现出它的生物活性,许多生物过程,产生有益的影响消化,吸收,和增长免疫力(13,14]。

此外,骆驼的牛奶在室温下可保存时间比其他动物的牛奶(15]。最知道骆驼的使用牛奶是药物对自身免疫性疾病、浮肿、黄疸,脾肿大,肺结核、哮喘、贫血、桩和糖尿病(16]。另外,骆驼的牛奶特点是抗毒素的效果在面对四氯化镉(17,18CCl),₄(19)、顺铂(20.),对乙酰氨基酚(21],氯化铝[22]。尽管如此,Althnaian et al。23)证实,骆驼牛奶CCl对具有保护作用₄诱导肝毒性。据我们所知,这种保护作用在抗氧化酶(猫、SOD、GPx活动、脂蛋白和谷胱甘肽水平)尚未阐明。因此,目前的调查重点评估hepato-preventive骆驼的潜力牛奶在同₄- - - - - -在活的有机体内——影响抗氧化剂酶活性和脂质过氧化反应表明在小鼠肝损伤。

方法和材料

牛奶取样

牛奶中使用本研究收集的单峰骆驼动物(Camelus单峰骆驼)从突尼斯南部Maghrabi品种。美联储单峰骆驼是全年只放牧。单峰骆驼手工挤奶,获得的样本收集到无菌瓶和立即转移到实验室。

动物

小鼠体重29 32 g从中心药房购买(SIPHAT,突尼斯)。动物被关在一个空调房间21±1°C(温度和相对湿度40%)12 h光/暗周期。所有小鼠自由获取饮用水和食物。颗粒状的饮食大鼠15%的蛋白质,提供集中的工业社会(SICO、斯法克斯、突尼斯)。根据一般指南的使用动物生活在科学调查、实验程序进行乐动KENO快乐彩(24)和伦理委员会批准的理学院斯法克斯。

试剂

本研究使用的试剂为分析纯。四氯化碳是来自SD精细化学品,Bhoisar,孟买,印度。5、5 ' -Dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB) LGlutathione(简化型),和所有当前的化学物质从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。

酶试剂盒

在实验结束时,血液样本收集与肝素主动脉穿刺的大坝。他们在3000转离心20分钟。血浆的氨基转移酶的活动,例如,一个lanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH) and ɤ-Glutamyl transpeptidase (ɤ-GT) kits were purchased from Bioerieux Laboratory. Triglycerides (TG), total cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol (LDL-Ch) and highdensity lipoprotein cholesterol (HDL-Ch) were obtained from the Beckman Coulter Laboratory (Brea, CA, USA).

体外研究

测定抗氧化活性

总抗氧化能力、DPPH自由基清除和减少权力抑制先后测量评价发酵的抗氧化活性牛奶和迷迭香提取物。

总抗氧化能力的测定

分析是基于减少莫(VI)莫(V)的提取和后续形成绿色磷酸/ Mo5 +复杂的酸性pH值(25]。一个整除(0.1毫升)稀释样品加上1毫升的试剂的解决方案。甲醇是用来代替样品空白。孵化后在沸水浴在95°C的90分钟。在混合物冷却至室温,吸光度值的均值为695 nm空白。抗氧化活性被表示为抗坏血酸的当量数t (mg抗坏血酸(AA) g⁻¹干重(DW))。

DPPH de-coloration化验

骆驼的抗氧化活动牛奶用DPPH法Hanato et al。26]。短暂,第1 - 40 1毫升的各种提取浓度(μg毫升⁻¹)被添加到250μL 0.2更易与L DPPH甲醇溶液。在黑暗中30分钟后在室温下。最终解决方案的吸光度当时读517海里,丁羟甲苯作为标准。清除DPPH自由基的能力计算使用以下方程:

DPPH•清除效果(%)= (A0-A1 / A0)×100

A0和A1的吸光度控制在30分钟和30分钟的A1样品的吸光度在30分钟。在一式三份样品进行了分析。

铁还原能力活动的方法

收紧过程进行描述,Megias et al。27]。短暂,适量的样本添加0.9毫升的试剂(0.83更易(TPTZ 2 4 6-Tripyridyl-sTriazine)和1.67更易与氯化铁在0.1摩尔醋酸缓冲(pH值3.6)和孵化25°C 10分钟。减少Fe3 + -TPTZ铁^{2 +}-TPTZ监控的吸光度增加595海里。Trolox被用作积极控制。测量了每个样本一式三份。

在活的有机体内研究

实验设计

28小鼠被随机分配到组,每组七个动物。组(C):控制老鼠收到蒸馏水;CCl集团₄CCl:₄肝毒性CCl病理模型)是一剂₄在0.3%(10毫升/公斤橄榄石油。在第14天ip);CM:日常管理由口腔填喂法0.4毫升的骆驼牛奶在15天;CCl CM组+₄:使用骆驼牛奶CCl和陶醉₄在14天。治疗期间,所有的动物幸存下来,体重每一天。

器官抽样

在实验的最后时期,控制和治疗小鼠腹部注射与水合氯醛麻醉后。血液样本收集与肱动脉肝素的动物。他们在15分钟2500克、离心机和储备−20°C到分析。肝脏解剖,清洗和衡量。一些样品均质(1:2,w / v)在50 L更易与三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.4)包含150更易使用ultra-Turrax设备/ L氯化钠。一些样品冲洗和均质在离心机5000 g 25分钟在4°C和整除的上层清液保持在−30°C到分析。并行,肝脏及其他器官的部分被立即固定到Bouin解决方案(饱和苦味酸添加37%到40%甲醛和冰醋酸,75:25:5 v / v)组织学研究[28]。

生化参数

蛋白质测定肝

肝蛋白质含量据布拉德福德(测定含量29日)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。

评价抗氧化酶和脂质过氧化水平

在肝脏的脂质过氧化水平估计通过测量硫代巴比土酸的形成活性物质(TBARS)根据八木的方法30.]。过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活动是确定在同一提取的方法Aebi [31日],拜尔和Fridovich [32],和Flohe Gunzler [33分别)。

肝脏谷胱甘肽含量

谷胱甘肽的内容被使用的方法估计Ellman [34)与5反应后,50-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸)。

组织病理学检查

肝组织标本来自松土后所有大鼠组。他们收集并固定在bouin解决方案和嵌入到石蜡,在2 - 5μm切片,苏木精和伊红染色组织学检查(35]。从每个肝脏准备8片。

统计分析

统计分析是使用单向方差分析以及Fisher执行其事后测试(PLSD)对比组(治疗组(三地₄和(C)]和[(厘米+创新领导力₄)和(三地₄)]。数据表示为±SE。差异被认为是重要的如果(P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001)。动力分析对每个参数进行测量,以确定样本容量。

结果

CCl的影响₄在健康死亡或流产不发生在任何实验组在治疗期间(15天)。然而,一些临床症状一被发现在老鼠,包括减少活动和明显的弱点。

骆驼奶的抗氧化活动

很明显从表1,骆驼牛奶样品有一个高能力清除DPPH *激进(IC50 = 0.63毫克/毫升)。它可以显示一个高亚铁离子螯合活性厘米。此外,它可以看出厘米揭示显著增加他们的总抗氧化能力(AAE 0.96毫克/毫升)。治疗对血清转氨酶、朋友、LDH和ɤgt的活动表2CCl显示:₄明显提高血清ALT, AST, PAL、LDH和ɤ小鼠肝脏的gt水平相比控制(+ 212%,P < 0.001;+ 75%,P < 0.01;+ 34%,P < 0.01;+ 72%,P < 0.01;分别为+ 109%,P < 0.001) (表2)。CM单独治疗没有造成任何影响本身在小鼠肝生物标志物。预处理和骆驼牛奶15天恢复ALT, AST, PAL、LDH和ɤgt (P < 0.01),没有达到正常的价值观。

价值观代表了意味着±SE 3复制。

表1。抗氧化活动在骆驼奶

表2。肝生物标志物(AST ALT、高山、LDH和ɤgt)在小鼠血浆水平与骆驼奶15天的治疗。

答:总抗氧化能力(mg AAE g⁻¹DW)。

b . DPPH清除活动(mg毫升⁻¹)。

c .收紧(μg毫升⁻¹)。

骆驼的影响牛奶对血脂

创新领导力₄导致严重的代谢变化小鼠肝脏,如图所示,显著增加甘油三酯(TG)(+ 121%)、总胆固醇(TC)(+ 43%)和LDL-Ch(+ 76%)水平,以及降低HDL水平(-49%)(表3)。治疗厘米并没有造成任何重大改变脂质在肝脏。预处理和骆驼牛奶15天恢复TG、TC和LDL-Ch水平(P < 0.01),没有达到正常的价值观。相反,CCl HDL-Ch水平有显著提高,隔开₄组。估计肝脏的脂质过氧化水平TBARS公布CCl的肝组织的增加₄对待动物相比,控制未经处理的小鼠(+ 151%,P < 0.001) (表4)。在这里,仅治疗厘米不造成任何影响本身的小鼠脂质过氧化水平。骆驼的使用牛奶减轻脂质过氧化反应没有达到正常的值(表4)。

表3。血清甘油三酯、胆固醇、HDL-Ch和LDL-Ch水平(mg / L)在小鼠治疗15天骆驼奶。

表4。骆驼的影响牛奶在小鼠肝脏氧化状态和抗氧化系统活动。

肝脏中谷胱甘肽水平的估计

注意到减少肝脏中谷胱甘肽水平明显在三地₄组(三倍,P <措施),而与控制(表4)。预处理和骆驼牛奶改善CCl与谷胱甘肽水平₄组。

酶促抗氧化状态在CCl肝脏的肝匀浆₄治疗小鼠SOD、猫和GPx活动显著降低-44.3%,- 5折,和分别为-1.3折,相比控制(表4)。预处理骆驼牛奶0.4毫升CCl改善这些参数相比₄集团没有达到正常的价值观。组织学研究生化修改上面提到的与我们的组织学研究(图。1)。事实上,在对照组显示正常肝的肝部分细胞(图。1。(一)]。CCl的管理₄造成了严重的肝细胞坏死,炎症和肝细胞膨胀图。1。(B, B)]。预处理和骆驼牛奶CCl的口头管理₄治疗小鼠(图。1。(C, C),肝脏的组织学方面比对照组部分逆转。肝脏的组织学方面的骆驼牛奶治疗组相似的控制(数据没有显示)。

讨论

肝纤维化是慢性肝损伤后伤口修复(36]。在这项研究中,我们评估的反应肝脏hepatotoxicants之前在小鼠肝损伤。首先,在我们的研究中,肝毒性CCl的₄老鼠是由血清参数的变化。检查肝是通过评估活动的血清ALT, AST,高山LDH和ɤgt是酶最初出现在细胞质中的浓度升高(37- - - - - -40]。肝病,这些酶逃到血液中按照肝损伤的程度(41,42]。我们的研究结果表明,CCl管理₄诱导酶水平与正常相比的一个重要高程控制。酶水平的升高,如天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶已经在老鼠CCl收到₄导致增加了细胞损伤、渗透性和肝细胞坏死(43- - - - - -44]。

作为膜结合酶、碱性磷酸酶与胆汁分泌影响肝脏时,有缺陷的排泄增加血清水平的这种酶(45]。第二,当活性氧物种攻击多不饱和脂肪酸,脂质过氧化反应产品构成膜结构和/或功能损害(46),通过海拔在CCl引起的肝纤维化₄(47]。事实上,目前的研究显示海拔的脂质过氧化水平与同治疗组小鼠的肝脏₄,导致组织损伤和抗氧化防御机制未能防止过多的自由基的形成(48- - - - - -50]。值得注意,预防治疗与骆驼牛奶被证明降低血清AST和ALT的崛起CCl活动引起的吗₄治疗的老鼠。这一发现意味着,骆驼牛奶CCl的挑战来保护肝组织吗₄受伤。CCl血清酶的增加引起的₄诱导肝损伤。骆驼牛奶通过其能力的胞内酶泄漏可能是预防膜稳定的活动。这是在协议与普遍接受的观点,血清转氨酶水平恢复正常肝实质的愈合和再生肝细胞(51]。

许多研究人员提供了一个重要的支持证明骆驼牛奶在肝损伤保护作用[19,52,53]。此外,这些研究坚持骆驼的保护作用牛奶对同₄全身的氧化压力老鼠是由于它的抗氧化性能。骆驼牛奶含有高浓度的维生素一、B2、C、E和非常丰富的镁和其他微量元素;这些维生素作为抗氧化剂和被发现是有益的在预防toxicant-induced组织损伤(54]。王亚南药物的效率是基于能力的减少危害或恢复正常肝的生理机能,由肝毒素分布。骆驼牛奶CCl减少₄测试组诱导酶水平升高,表明hepatocytic的结构完整性保护细胞膜或受损肝脏的再生细胞(55]。第二,预防治疗厘米可以修复和保护肝脏组织的稳定细胞膜和胞内酶泄漏的预防。可以得出结论,血清转氨酶水平的逆转是由于肝实质的修复和愈合过程细胞(56]。CM之前报告的影响在一些相关主题(57,58),该属性有害肝效果恢复,恢复正常生理;CM消费,影响肝细胞的再生和保护膜完整性(59]。

第三,本研究也证明,创新领导力₄治疗会影响肝脏的脂质代谢(甘油三酸酯和胆固醇水平)。CCl这是从目前的观察,得出结论₄导致显著增加(P < .0.05)脂质参数的水平。Althnaian et al。60CCl)确认:₄中毒相似,肝炎甘油三酯的分解代谢。此外,它可以假定在同华高胆固醇血症₄醉酒小鼠的肝实质损害的结果细胞,导致肝脏脂质代谢障碍61年]。然而,骆驼的有利影响牛奶对脂质代谢没有被研究过。我们的数据显示,三酰甘油胆固醇明显下降,低密度值,但它增加了CCl相比,高密度脂蛋白胆固醇水平₄喝醉了的老鼠。脂类的主要作用是降低骆驼牛奶这可能归因于一个抑制活动微粒体酰基辅酶A:胆固醇acyltransferease体外。后者负责酰化的胆固醇在肝脏胆固醇酯(61年]。

结论

总之,同₄治疗导致肝和肝损伤,氧化损伤和组织病理学变化。预处理和骆驼牛奶导致肝脏疾病的一个重要衰减。我们的研究结果表明,预处理与骆驼牛奶可能是一个有用的助手为了避免CCl毒性引起的吗₄。还需要进一步的研究来发现新的药理方法和确定骆驼奶的确切机械化的途径。

确认

目前的工作是由DGRST格兰特(方向兴业银行de la任职et Technique-Tunisie(预备队说是德大学医疗基地UR / 13 es - 73)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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