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组胺和Beta-Hexosaminidase抑制原油生物碱的影响从Kopsia arborea布鲁姆RBL-2H3细胞系

*通信:

侯赛因K、学院制药、药物和草药研究中心,马来西亚Kebangsaan大学,道路拉穆达50300年阿卜杜勒·阿齐兹,吉隆坡,马来西亚,电话:+ 603 - 92897306;电子邮件:khairana@ukm.edu.my

文摘

Kopsia arborea布卢姆是夹竹桃科植物的家族之一,在东南亚和马来西亚。它已经被广泛应用于传统药物。提取和纯Kopsia隔离物种已报告表现出不同的生物活性。原油生物碱在这项研究中,来自不同地区的k . arborea评估他们的抑制活动释放组胺和beta-hexosaminidase老鼠嗜碱细胞白血病(RBL-2H3)。k的影响arborea组胺,beta-hexosaminidase RBL-2H3细胞释放和beta-hexosaminidase活动是由使用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)。另一方面,细胞毒性效应的原油生物碱RBL-2H3细胞被评价标准3 - (4 5-dimetiltiazol-2-Yl) 2、5-difeniltetrazolium (MTT)测定。结果表明,所有样本显著抑制(p≤0.001)的组胺释放RBL-2H3细胞除了k arborea(根)。然而,%抑制组胺释放证明了原油生物碱提取k arborea叶子高酮替芬延胡索酸酯相比,充当积极的控制。与此同时,原油生物碱提取k arborea(根)表现出的最高抑制beta-hexosaminidase释放比酮替芬延胡索酸酯和活动。这些结果表明,原油从这种植物的生物碱生物活性化合物哪有能力抑制柱状细胞通过抑制组胺和脱粒beta-hexosaminidase释放和有潜力提供替代抗过敏剂。

关键字

RBL-2H3细胞;组胺;抗过敏活性;生物碱;Kopsiaarborea

介绍

众所周知,过敏反应与肥大细胞的脱颗粒有关。很多发挥关键作用的介质传播发布的过敏反应的桅杆上细胞(1]。针对1型过敏反应,刺激柱状细胞释放组胺过敏反应的最有效的介质(2,3]。组胺和其他介质促进平滑肌收缩,血管扩张,增加血管通透性(4]。Beta-hexosaminidase,一个重要的代谢酶负责糖蛋白在细胞内稳态,存储在桅杆的分泌颗粒细胞(5]。激活肥大细胞释放beta-hexosaminidase与组胺。抑制beta-hexosaminidase释放是一个关键的战略遏制桅杆的脱粒过程细胞(6- - - - - -8]。因此,各种抗过敏的研究涉及beta-hexosaminidase作为标记的使用柱状细胞脱粒的老鼠嗜碱性的白血病细胞株(RBL-2H3)。

许多抗过敏可显示各种副作用(6]。几个世纪以来,人类一直在使用的药用植物各种疾病的疾病。因此,草药的使用医学和孤立的活动根可以提供另一种方式用于治疗过敏。先前的研究已经报道,生物碱化合物分离大量的植物物种如N-methylbuxifoliadine-E N-methylatalaphylline, citrusinine-I [8),ganocalicine (9],curine [10],dichotomines [11],warifteine [12)具有抗过敏的活动。然而,没有进行抗过敏的研究生物碱从Kopsia物种。

Kopsia属夹竹桃科的一员家庭是一个著名的吲哚生物碱的来源。大约有18物种的Kopsia发生在马来西亚包括k . arborea广泛分布在东南亚特别是在马来西亚半岛和沙捞越13- - - - - -15]。在马来西亚,很多Kopsia物种使用传统的医学在三期梅毒治疗溃烂的鼻子,皮肤感染和伤口16]。各种提取和活性物质隔绝Kopsia物种也被报道表现出众多的生物活动,如抗菌、抗癌、抗炎、解热和止咳药17- - - - - -19]。在当前的研究中,一个的Kopsia物种这是k . arborea(同义词Kopsiascortechinii国王和赌博)进行了调查和抑制的影响k . arborea原油生物碱对组胺和beta-hexosaminidase RBL-2H3释放细胞进行了评估。

材料和方法

材料

最低基本鹰介质(MEM)和青霉素和链霉素获得Gibco(热费希尔科学USA Inc .)。Anti-DNP-IgE(单克隆anti-DNP),胎牛血清的边后卫和dinitrophenylated牛血清白蛋白(DNP-BSA)从西格玛奥德里奇,购买美国。p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide获得热费希尔,英国和酮替芬延胡索酸酯作为积极控制买来Abcam生化药剂,剑桥,美国。

植物材料

k . arborea收集从森林的吉兰丹州,马来西亚。样本被马来西亚Kebangsaan大学的植物学家和沉积在UKM的标本UKMB40000凭证号码。

原油提取生物碱

干的样本k . arborea被简单的浸渍方法提取。接地的植物样本与无水甲醇浸泡72小时在室温下,产生甲醇提取的三倍。原油生物碱被酸碱提取方法获得的。简单地说,5%的甲醇提取物是酸化水H₂所以₄(100毫升)。酸化提取与10% Na盐碱化₂有限公司₃,其次是与CHCl分区₃。收集的生物碱层然后用分液漏斗。Na₂所以₄增加了去除水分。生物碱层集中用旋转蒸发器。百分比收益率植物样品中列出的每个部分表1。

表1:提取植物样品的每个部分的产量

RBL-2H3细胞的制备和细胞生存能力

RBL-2H3细胞是一种广泛使用的过敏研究,因为他们的粘膜柱状细胞丰富的IgE受体膜等特点,能够释放介质后IgE-sensitization [20.]。尽管如此,RBL-2H3 Passante和法兰克人的报告细胞没有更合适的代表肥大细胞在过敏但是作为我们的研究作为研究初步研究确定原油的潜力生物碱的k . arborea组胺和beta-hexosaminidase释放抑制(21]。因此,RBL-2H3细胞仍被视为与被选择作为一个吗模型为柱状细胞在本研究ige脱粒。

RBL-2H3细胞由美国提供类型的细胞培养(写明ATCC),在最低基本培养基培养鹰(MEM)包含10%的胎牛血清和1%的抗生素(青霉素、链霉素)在培养瓶。的细胞被维持在37°C和5%的公司吗₂。RBL-2H3样本的细胞毒性效应细胞是由使用标准MTT测定方法。生存能力的百分比计算,只有细胞生存能力比例超过90%被用于进一步的分析以确保最大柱状细胞可以实现脱粒[22]。

组胺释放试验

RBL-2H3细胞(2×10⁵细胞/毫升)在24-well培养板。单克隆鼠标anti-DNP IgE(0.45μg /毫升)添加和孵化24小时。在完成潜伏期,单克隆鼠标anti-DNP IgE-treated细胞与Siraganian洗两次缓冲区(氯化钠119 mM,氯化钾5毫米,MgCl吗₂0.4毫米、管道25毫米,氢氧化钠40毫米与pH值7.2)紧随其后的160μL Siraganian缓冲孵化10分钟37°C。孵化后,IgE-sensitized细胞治疗与集成电路₁₀的样本值10分钟紧随其后的20μL dinitrophenyl-labeled牛血清白蛋白(DNP-BSA)(10μg /毫升)和进一步孵化20分钟。50μL上层清液的退出并添加在96孔板。组胺浓度量化了ELISA技术(ELab科学,中国)。ELISA进行了一式三份按照制造商的指示。抑制组胺释放百分比计算如下:[10,23]。

抑制组胺释放(%)=(1 -(样本- -控制)/(积极控制——消极控制)]×100。

Beta-hexosaminidase释放试验

对从RBL-2H3释放beta-hexosaminidase抑制性影响细胞系进行评估遵循的方法Tewtrakul Subhadirasakul和次要的修改通过使用0.1米甘氨酸缓冲,pH值10.0停止解决方案(23,24]。同时,beta-hexosaminidase释放的抑制百分比计算如下:

抑制beta-hexosaminidase释放(%)=(1 -(测试- -控制)/(积极控制——消极控制)]×100。

Beta-hexosaminidase活动分析

从RBL-2H3 beta-hexosaminidase抑制性影响活动细胞系也评估采用的方法Tewtrakul和Subhadirasakul小修改,0.1米甘氨酸缓冲,pH值10.0是用作停止解决方案(23,24]。beta-hexosaminidase活动的抑制百分比计算如下:

抑制beta-hexosaminidase释放(%)=(1 -(测试- -控制)/(积极控制——消极控制)]×100。

统计分析

结果表示为一个均值±S.E.米三个决定。的集成电路₁₀值计算程序使用Microsoft Excel。统计显著性检验用单向方差分析,其次是Dunnett的测试。

结果与讨论

原油生物碱对beta-hexosaminidase发布和活动

Beta-hexosaminidase就是存储在一种酶柱状细胞粒脱粒过程发生时,一起释放组胺(25]。抑制性的影响原油生物碱样品RBL-2H3脱粒活动细胞确定通过测量释放beta-hexosaminidase颗粒的标记(6]。作品从RBL-2H3 beta-hexosaminidase细胞测量采用ELISA和结果证明是抑制百分比。所示表2,结果表明,所有测试原油生物碱提取物k . arborea抑制beta-hexosaminidase的释放。抑制活性的k . arborea(叶)和k . arborea(根)更高的比酮替芬延胡索酸酯是积极的控制(IC₁₀= 1.37μg / ml, 41.80±1.0%)。

表2:抑制性的影响k arborea原油生物碱组胺的释放和β-hexosaminidase RBL-2H3细胞。

Beta-hexosaminidase活动进行分析确认结果因为脱粒过程的抑制在桅杆上细胞而不是由于抑制酶活性(6]。结果在表2除了显示,所有样品测试k . arborea(根)给低抑制作用显著(< 15%),证明了高beta-hexosaminidase释放抑制效应的结果,因为原油生物碱样品对脱粒肥大细胞的过程。然而,根据拉尔森和斜接的研究发现,组胺释放的抑制百分比给更敏感的检测结果在桅杆上细胞脱粒相比beta-hexosaminidase释放(26]。因此,组胺释放试验进行了识别原油生物碱提取物的抑制效应k . arborea对脱粒肥大细胞的过程。

原油生物碱对组胺释放

组胺是一种重要的介质,包括在脱粒过程中扮演角色的早期阶段I型超敏反应(4,7,27]。三种原油生物碱提取的不同部分k . arborea也会遇到他们的抑制作用在RBL-2H3组胺释放吗细胞通过使用ELISA。所示的结果表2这是观察到整个原油生物碱样本表现出组胺释放IgE-sensitized RBL-2H3细胞。在所有的测试样本,原油生物碱提取来自树叶(IC₁₀= 2.58μg /毫升)显示的最大抑制组胺释放显著(50.62±3.8%)。此外样本来自树叶的抑制作用k . arborea高于积极控制(45.22±10.0%)。

这些发现表明,原油的生物碱k . arborea(树叶)具有高潜在替代anti-histamine代理。然而,需要进一步的探索这种植物来确定负责活动的生物活性化合物。背后的机制进一步抑制组胺释放所有样本的原油生物碱提取仍需调查。强有力的原油的分离和纯化生物碱提取正在进行确定分离化合物的抑制作用在释放组胺和beta-hexosaminidase RBL-2H3细胞系。

结论

作为结论,所有测试结果描述,原油生物碱提取、k . arborea(树叶)显示最强的抑制柱状细胞脱粒。本研究结果表明,原油从这种植物生物碱提取的潜力生物活性化合物它能够抑制柱状细胞通过抑制组胺和脱粒beta-hexosaminidase发布和提供了一个新发现的的洞察力替代anti-histamine代理过敏治疗。

确认

这项研究是由基本特性/ 1/2012 / STG08 / UKM / 02/8。我们的确认也去研究中心和仪表,UKM赞助。

引用

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