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组织病理学的影响双歧杆菌种虫害Balbc老鼠的鼠伤寒沙门氏菌感染

*通信:

Naeem正义与发展党,学院生物学系教育镇的大学女孩,伊拉克,电话:+ 964 (0)726 521 7601;电子邮件: (电子邮件保护)

文摘

本研究涉及的隔离和表征从粪便双歧杆菌和婴儿健康的人。共收集66例孤立随机从健康人和婴儿Al-Najaf Al-Ashraf城市1/2012-4/2012期间。标识隔离进行了根据他们的角色在选择性的媒体、生化试验和聚合酶链反应技术(PCR)。我们的结果表明,所有66隔离属于双歧杆菌spp。而这些隔离属于b对象根据PCR的结果。此外,解释双歧杆菌的作用在减少感染致病菌种虫害,进行了试验研究。鼠伤寒沙门氏菌被用作病原体感染Balb / C小鼠作为模型实验研究。结果显示,老鼠与双歧杆菌和鼠伤寒感染美国管理显示没有沙门氏菌病的重要临床症状与病理组织病理学变化相比,老鼠感染美国沙门氏菌感染(负控制)。此外,结果表明,庆大霉素治疗小鼠接种影响很小双歧杆菌和沙门氏菌感染,感染与小鼠相比只感染了美国沙门氏菌感染。

关键字

益生菌;美国沙门氏菌感染;聚合酶链反应;组织病理学;致病性

介绍

双歧杆菌属种虫害是一种最广泛使用的益生菌。这些微生物是常见的人类肠道微生物群的成员,他们占主导地位在母乳喂养的婴儿1]。

双歧杆菌属是一种革兰氏阳性细菌,non-motile non-spore成型,不规则棒和专性厌氧2]。一些典型的栖息地双歧杆菌属是一个人,蜜蜂肠道和温血动物。双歧杆菌属其中常见的共生的人类和动物肠道微生物区系组成去粪微生物区系的成人总数的3%和91%的总在婴儿母乳喂养婴儿的肠道微生物区系虽然形式喂养婴儿配方奶粉(75%3,4]。

分类和识别双歧杆菌属物种通过传统的方法依赖于碳水化合物发酵模式已被证明是毒株特异性而不是种专一性(5]在分子识别根据16 srdna已经证明是一个强力的微小的方法来确定系统的关系在双歧杆菌属显示超过99%的序列相似性在群内吗双歧杆菌属(5- - - - - -7]。目前,双歧杆菌属由超过30物种与正确的名字发表,其中一个还亚种(8- - - - - -10]。

几项研究的作用双歧杆菌属物种在维护一般健康因为有益的影响双歧杆菌属对人类健康如(我)刺激免疫反应。(2)减少许多潜在的病原体的生长。(3)抑制costiveness、腹泻等肠道感染。(v)增强乳糖耐受性及(iv)它可以用来恢复肠道微生物区系一种抗生素治疗后(11,12]。

的机制双歧杆菌属涉及之间的交互可以发挥他们的有用的影响呢双歧杆菌属和粘膜上皮细胞扮演了一个重要的角色在防御屏障,区分入侵微organisme从一个站点和无害的微生物和饮食抗原在他人和细胞因子生产商(13]。另外,其他的研究表明双歧杆菌属和其他乳酸菌可以提高例如fucosylation糖脂的吗细胞小肠的修改宿主环境(14,15]。本研究旨在解释的作用双歧杆菌属物种在实验室动物在减少病原体的作用。

材料和方法

收集的标本

收集粪便样本期间从健康婴儿和正常的人在无菌scrow 2012/1-2012/4警察,以避免任何可能的污染和与生理盐水混合,形成一个暂停,然后0.1毫升的暂停凳子以拼箱的形式培养琼脂,琼脂夫人,孵化24小时37°C。在厌氧条件下。

双歧杆菌spp的识别。

•传统方法:琼脂可疑菌落出现在拼箱和太太都进一步确定确定根据文化和生化测试描述之前(16]。

•的分子识别b .对象:碱性溶解方法描述Sambrook和罗素17)进行了提取的DNA鉴定双歧杆菌属种虫害的聚合酶链反应技术。为了放大16 s rDNA基因在基因组DNA的一组引物被使用(Pbi (F, 5´-CCGGAATAGCTCC-3´和R, 5´-GACCATGCACCACCTGTGAA-3”)双歧杆菌属仕达屋优先计划。虽然Bil (F, 5´——AGTTGATCGCATGGTCTTCT-3´和正R 5´- CCATCTCTGGGATC-3´被用于识别b .对象(18]。聚合酶链反应包括5μL放大的解决方案聚合酶链反应主混合(DNA聚合酶1 u, 250μM每个dATp dGTp, dCTp dTTp, Tris-HCL (PH值9.0),10毫米,氯化钾,30毫米和1.5毫米MgCL,稳定和跟踪染料),2.5μL每个引物和5μL提取DNA。完成最后的体积混合到20μL通过添加核酸酶1分钟的免费水和自旋混合物。聚合酶链反应进行了以下条件:92°C 5分钟之后
92°C的35周期为30秒,30秒52°C, 72°C与最终扩展1分钟10分钟的72°C。

由此产生的聚合酶链反应产品收益率在1%琼脂糖凝胶电泳扩增子的914个基点双歧杆菌spp和837个基点b .对象(18]。

实验的程序

动物

完全成熟的Balb / c小鼠(男性和女性)获得兽医学院/镇的大学和住在干净的塑料笼子在室温下在动物学院的房子教育为女孩? s /镇大学适应和繁殖。被小心地避免任何不必要的压力。

所有的动物饲料和自由的在笼子里有自来水。经过4个月的繁殖,最终用于实验研究的动物数量是50男性,年龄不等分裂到8 - 16个星期,体重之间23-33 g之间不等。

估计感染剂量(ID)

准备ofsalmonella培养的悬架:每毫升集落形成单位(CFU /毫升)美国沙门氏菌感染从大学获得的医学/镇大学根据英里的方法计算了et al。19通过接种BH Iagar 5殖民地美国沙门氏菌感染为24小时,在37°C的环境。离心分离进行了在8000转/ 10分钟,洗了三次颗粒与PBS和resuspended PBS的颗粒1毫升。十倍稀释了,计算每个稀释剂和选择的CFU /毫升以下浓度的稀释剂湿透老鼠:(9×10⁶CFU /毫升),(7×10⁷CFU /毫升),(8×10⁸CFU /毫升),(5×10⁹CFU /毫升),(4×10¹⁰CFU /毫升)和(7×10¹¹CFU /毫升)。

接种小鼠:35健康雄性老鼠被选为评估感染剂量和分成七个组每组包含五个老鼠。每一个六组小鼠湿透口头与1毫升的每个计算(CFU /毫升)稀释剂用注射器而对照组湿透磷酸缓冲盐(PH = 7.2)。

估计感染剂量,所有组都注意到30天计算生活和死老鼠,确定通过选择一组老鼠的表明临床症状类似发现沙门氏菌没有死亡率(20.]。临床症状的出现后,两只老鼠被牺牲验尸的隔离美国沙门氏菌感染从内部器官。

双歧杆菌的影响在老鼠身上种虫害

接种的老鼠与双歧杆菌spp。两组健康的雄性老鼠含有每组5只老鼠湿透了1毫升的8×10⁸CFU /毫升双歧杆菌属spp口头通过使用注射器(19]。所有老鼠都经历了日常观察和老鼠粪便样本收集每日的隔离双歧杆菌属spp。

实验诱导沙门氏菌病

三组健康的雄性老鼠包含每组5只老鼠被用在这个实验除了准备作为两组双歧杆菌属种虫害的治疗。每组老鼠都是用1毫升的感染剂量的口服药物美国沙门氏菌感染和观察到的日常和感染后,这个观察包括温度等重要的临床检查、食欲,出现腹泻、脱水、临床症状和体重。

后出现临床症状而被感染的老鼠与沙门氏菌病,两组的老鼠,一个治疗之前双歧杆菌属种虫害是注射庆大霉素每天两次(每12小时)。

收集血液样本通过验尸后心脏穿刺技术,把它放在一个包含EDTA管,轻轻混合,用于血液测试。的多个部分肝、肠和胃都是沾hematoxyline污渍。

统计分析

Stagraphic + 5.1软件被用于统计分析(Manugistics,罗克维尔市,医学博士,美国)。方差分析是评估之间的显著差异意味着与事后费舍尔最显著差异(LSD)测试在P < 0.05。数据表示为平均值和标准偏差(SD)决定在四个独立的实验中重复的措施。

结果

双歧杆菌的分离和鉴定

最初的识别双歧杆菌属种虫害取决于菌落形态、细胞和生化测试的显微镜检查。显微镜检查的双歧杆菌属种虫害显示这是革兰氏阳性支或多形性棒出现Y和V形。殖民地出现小,白色的奶油色和非能动的琼脂夫人。所有隔离显示负溶血时在血琼脂基生长。最优增长的温度双歧杆菌属种虫害隔离37°C,它可以在40°C在厌氧条件下生长。

分离都是过氧化氢酶和氧化酶-。柠檬酸分离株生长的能力西蒙是变量和一些分离发酵葡萄糖的能力没有天然气生产所示起亚测试显示一个酸/酸。所有隔离显示阴性结果吲哚、甲基红和流行过Proskauer测试。

双歧杆菌的分子识别。

分子的方法通过使用聚合酶链反应技术放大特定的基因(16 srdna基因)被用于特定的识别双歧杆菌属仕达屋优先计划。放大的结果聚合酶链反应16 SrDNA所示图1。双歧杆菌spp。被确认的聚合酶链反应当扩增子是描述与分子量(914)英国石油公司。所有隔离显示+ ve DNA扩增结果。另一方面,识别双歧杆菌属种虫害,物种水平是由放大16 srdna识别的特定基因b .对象时发现一个扩增子分子量(837)英国石油公司被放大。

识别双歧杆菌属种虫害从人类粪便分离,种专一性聚合酶链反应技术使用。结果表明,这些属于隔离b .对象。

实验研究的结果

结果表明,感染剂量的美国沙门氏菌感染在老鼠身上湿透与细菌(8×10⁸CFU /毫升)通过计算死亡,活在每组(30)天所示表1。

表1:估计感染剂量(ID)的s typhimuriumin老鼠。

当我们显示在这个剂量临床症状的老鼠活沙门氏菌病如迟钝、腹泻、虚弱、发烧、食欲不振、体重下降。另一方面,管理1毫升(8×10⁸CFU /毫升)双歧杆菌属种虫害的隔离双歧杆菌属种虫害老鼠的大便里没有任何改变外表称为细菌的适应和能力在肠道正常。

实验诱导沙门氏菌病

感染剂量估算后,五组健康的雄性老鼠(每组5只老鼠)进行了临床观察和其他检查如下:

日常的观察临床症状:+ ve控制组的老鼠没有显示任何重要实验期间临床症状持续了比较(30)天的临床症状出现在老鼠负对照组包括;迟钝、腹泻、虚弱、发烧、食欲不振、体重下降。另一方面,集团此前与治疗双歧杆菌属种虫害显示更少的临床症状包括:增加体重,腹部肿大。

血液测试:血液分析仪的结果相比,控制+ ve和控制负所示表2和3。我们的数据称为一个显著增加白细胞,红细胞,HCT, MCV和血红蛋白明显下降,妇幼保健、MCHC, PLT, LYM %, LYM操纵组与+ ve控制相比,虽然有显著增加的白细胞,红细胞,血红蛋白,HCT、MCV、PLT, LYM %显著降低妇幼保健、MCHC, LYM治疗组相比,负控制。

表2:。双歧杆菌的影响种虫害和药物在小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌生理参数(相比之下,积极控制)。

表3:的影响双歧杆菌属种虫害和药物在小鼠感染生理参数鼠伤寒沙门氏菌(相对于消极的控制)。

病理变化

因为它所示图。2,2 b,2摄氏度没有明显的病理变化+ ve组和组管理双歧杆菌属种虫害与负控制相比,表现出显著的病理变化。动物3和5天后检查后感染。两只老鼠在每一次牺牲验尸。

为期三天的感染后:经过3天的接种小鼠牺牲并显示以下重大变化如下:

•组负控制:规模扩大观察肝脏,脾脏,肠系膜淋巴结和减少胃的大小和心脏。大肠显示服务器拥堵,满是粪便。因为它所示图2 b。。

•双歧杆菌治疗组spp。扩大规模的肝脏,脾脏,肠系膜淋巴结和心脏,减少胃的大小。大肠显示服务器拥堵和满是小的粪便量(图2 d。)。

•双歧杆菌治疗组和庆大霉素:因为它所示图2 e。在肝脏的大小,有扩大肠系膜淋巴结和心脏,增加胃的大小。大肠显示服务器拥堵,满是粪便。

•组仅用庆大霉素治疗:扩大在肝脏的大小(小),肠系膜淋巴结和心脏与正常胃的大小。大肠显示服务器拥堵和满是小的粪便量(图2 f。)。

•组织病理学:多个部分是从肝脏和肠道准备从每组的老鼠。的结果组织病理学所示的是图。3和4。

•PBS治疗组:结果显示没有黏膜的形态学和上皮细胞的变化(图。2和3)。

•组感染沙门氏菌:Amucosal自我分解和一些背景的变化通常是指出当一小部分肠道组织检查,包括淋巴恶性plesia和子粘膜水肿。门静脉周的炎症未经检验的准确,低littersneutrophils数量和淋巴细胞被认为是背景层面观察,也在他们的肝脏有pyogranulonas adminstered价格相比之前双歧杆菌属显示没有pyogranulonas肝脏(图2 b。和2摄氏度&图3 b。和3 c)。

•接种美国沙门氏菌感染在小肠导致扩散(灶)肠坏死的血管变性和分解的绒毛与细菌粘附和入侵,侵蚀和溃疡坏死的上皮细胞层和底层板propia。没有多形核白细胞浸润orinflammatory变化观察这些地区接壤。

沙门氏菌和双歧杆菌治疗组:当小鼠接种之前双歧杆菌属种虫害和感染美国沙门氏菌感染(图2 c。和图3 c。)结果显示没有形态变化粘膜上皮。

讨论

双歧杆菌spp的识别。

双歧杆菌属新生儿肠道的自然微生物,与母乳营养。它能够生存或繁殖在相对较高的温度(46°C)。

生化测试用于识别双歧杆菌属种虫害,物种水平是变量。所有隔离先生和白明胶酶显示阴性结果。这一发现表明,一些隔离仍然生产葡萄糖酸的结果发酵但是他们有较低的氢离子浓度,因为回到中立的进一步退化引起的有机酸碳酸盐,和二氧化碳和可能形成铵化合物蛋白质的媒介,而其他积极的隔离有能力克服系统的缓冲能力,生产和维护稳定的葡萄糖酸的最终产品发酵(16]。

一个变量与柠檬酸西蒙测试结果也显示这是由于一些孤立的能力利用柠檬酸作为唯一的碳来源取决于citritase或柠檬酸歧化酶,而其他隔离可以通过三羧酸循环柠檬酸代谢迅速出现发酵或乳酸生产。

我们的研究结果是在协议与其他研究发现广泛的分布双歧杆菌spp在凳子上的婴儿和人2,21- - - - - -23]。此外,我们的结果是同意齐内丁和费德山口24发现只有3株b .对象从26隔离属于双歧杆菌属。

16 srdna基因导致被用作描述精确的方法双歧杆菌属建人类肠道。一种特异的聚合酶链反应技术与提取的DNA也被用于调查的分布双歧杆菌属在成人和婴儿的肠道微生物区系。

所示的结果图。1在协议与丹尼斯和史蒂芬18透露具体的放大双歧杆菌属DNA是实现与底漆Pbi F1结合底漆Pbi R2的所有压力测试(25,26),发现16 srrna基因被认为是全球出现在细菌和序列表现出高度的保护。的高度保守的部分16 s rDNA基因perfectto rDNA基因设计引物,扩增小亚基(27]。属的系统发育分析双歧杆菌属是根据这个基因的序列同源性分析。一些研究证实使用16 s rDNA基因的识别双歧杆菌属如Baffoni et al。28)培养hsp60在一个简单的全球底漆聚合酶链反应程序时(29日的序列相比)基因组的b . animalis无性系种群。写明ATCC 27673与其他菌株利用分子工具Lactis益生菌的活动。

实验研究

沙门氏菌生物是负责最常见和重要的人畜共患疾病(30.]。沙门氏菌病仍是三种最常见的一种肉相关疾病在人类[31日]。动物产品很容易受微生物污染和支持他们的增长如果不方便处理,处理和保存32,33]。

益生菌参与提供主机的人畜共患病原菌耐药性提升导致肠胃炎(34]。管理益生菌预计能够殖民肠诱导长期有益肠道健康。双歧杆菌属是人类的正常肠道菌群的一部分,可以构成受饮食和年龄等因素的影响。一些研究发现,双歧杆菌属显著降低的殖民化美国沙门氏菌感染在Balb / c小鼠模型中,一个模型已经广泛enteropathogens特征(35,36和使用美国沙门氏菌感染在模型被认为是一个有效的假肢吗模型的伤寒杆菌人类感染(36]。

如前所述,我们的研究结果表明感染剂量的美国沙门氏菌感染是8×10⁸CFU /毫升是近似的,注意到麦克斯韦(37)表明,感染剂量介于10之间⁵-10年¹⁰CFU /毫升。此外,与其他研究结果一致,如Al-Naqeeb [38谁发现的ID美国哈达尔发现老鼠是1.7×107 CFU /毫升,Al-Mansory [39那些记录的IDSalmonellaenteritidis在兔子(2×10⁸CFU /毫升)。

在感染,沙门氏菌在胃肠道的鼠标,然后穿透ilealPeyers补丁感应全身感染(40]。的形成生物膜在反应堆增加消毒耐药性,发挥重要作用的持久性沙门氏菌(41]。见我们的实验研究,临床症状所致美国沙门氏菌感染组不进行治疗之前双歧杆菌属被Al-Naqeeb(类似报道38]发现老鼠的重要临床症状如发烧、食欲不振、口渴、腹泻和过去的一致性,减少活动,这些迹象持续72小时。

每日观察是在与其他类型的相关协议与其他研究沙门氏菌物种造成相同的临床症状如Al-Mansory [39]和Harab [42),记录在兔感染相同的临床症状沙门氏菌肠炎和美国哈达尔发现分别。临床症状的出现表明致病性沙门氏菌入侵小和大肠粘膜产生毒素如内毒素、细胞毒素,肠毒素、外毒素和刺激的释放炎症细胞因子和诱导急性炎症反应。从肠道细菌可以传播到其他器官,引起系统性感染(43]。温度的升高是由于内生致热源在巨噬细胞产生的细胞因子il - 1对内毒素的回应。这些内生致热源循环血液和行为刺激下丘脑的体温调节中枢引起发烧(44,45]。

双歧杆菌属是一个特定的更具吸引力的潜力益生菌对人类构成的一个普遍人群时正常的结肠微生物群,非常适应于这个生态系统。人类双歧杆菌属有抗菌活性菌株美国沙门氏菌感染和显示两个其中表达对立的活动体内。正如前面我们提到在治疗组双歧杆菌属和感染美国沙门氏菌感染我们与其他研究结果一致,发现入侵美国沙门氏菌感染被抑制的存在吗双歧杆菌属以及生命起源以前的饮食可能有anti-adhesive效应在主机36,34,40]。母乳喂养可以降低婴儿的风险新生儿坏死性小肠结肠炎(46,47),可以限制肠胃炎由轮状病毒引起的严重程度(46)相比,配方奶粉喂养,被认为是部分原因的优势双歧杆菌,抑制大肠杆菌和其他潜在致病菌在母乳喂养婴儿的肠48- - - - - -50]。

Marteau et al。51)报道,益生菌,如乳酸菌和双歧杆菌属被利用在分配的肠道菌群与腹泻疾病的治疗。的抑制作用美国沙门氏菌感染通过双歧杆菌属也可能由于他们的能力减少大肠的pH值通过生产乳酸和乙酸通过限制许多潜在的病原体的生长和腐烂的细菌52]。同时,双歧杆菌属可能抑制致病菌的粘附肠道感染的上皮细胞的第一步53,54]。的能力双歧杆菌属增加肠道屏障对病原体首先通过加强物理抗性的上皮细胞层和第二调制向预先激活免疫系统稳态(55,56]。

一个可能的机制,解释我们的结果的潜在能力双歧杆菌属绑定内毒素。实际上,几株益生菌已经被证明能够绑定特定细胞表面的真菌毒素(57,58]。少出现临床症状的治疗双歧杆菌属增强机体的细胞免疫反应,包括吞噬作用,淋巴细胞增殖和细胞因子的生产59李)以及体液免疫反应et al。60),席尔瓦et al。61年和蜀et al。62年)似乎表明,这种改进将增加抗肠道感染鼠伤寒沙门氏菌(34,63年,64年]。表明生命起源以前的可能绑定特定的宿主上皮细胞表面受体,从而预防依从性和随后的入侵美国沙门氏菌感染(65年)指出,某些共生产生分子可能影响宿主的免疫系统,防止肠道炎症。其他的研究表明,益生菌微生物如双歧杆菌属和乳酸菌可以通过互动发挥他们的免疫调节效应toll样受体2 (TLR2),描述组件的细胞壁肽聚糖等lipoteichoic酸,和脂蛋白66年- - - - - -68年]。一项研究由陈钰[69]证明了一些双歧杆菌属压力保护上皮紧密连接(TJ)屏障对全身的TNF-α损伤和促进上皮屏障完整性的恢复TNF-α-induced损失归因于增加生产醋酸和甲酸。Miyauchi等人,Sultana et al。70年,71年)报道,细胞壁成分来自一些双歧杆菌属和肠球菌压力也提高上皮TJ通过TLR2-mediated机制明显障碍。

血液学的分析器的老鼠感染的结果沙门氏菌在协议与其他研究的结果如桑托斯et al。72年发现红细胞增加,Hb和PCV响棒实验感染鼠伤寒沙门氏菌古普塔等人,和Raghad73年,74年)在豚鼠实验感染都柏林美国和Sharma et al。75年在实验感染山羊鼠伤寒沙门氏菌;Harab(42]和Raghad [74年在兔子感染美国哈达尔发现。病理发现的结果美国沙门氏菌感染在老鼠同意Harab的结果(42)在兔感染发现了相同的结果美国哈达尔发现。

的结果组织病理学的效果双歧杆菌属对小鼠感染沙门氏菌病是在协议与40发现同样的效果的生命起源以前的Bimuno所产生的双歧杆菌属bifidum。一些研究发现,双歧杆菌属降低了入侵的美国沙门氏菌感染在感染的早期阶段,因此执行保留美国沙门氏菌感染在降低胃肠道或显著下降的殖民化美国沙门氏菌感染在所有器官40,65年,76年,77年]。

另一方面治疗的结果是同意Asahara [78年)发现,治疗与某些传统的老鼠双歧杆菌属(b .谕令和b . pseudocatenulatum,10⁸CFU /鼠标)一起益生元禁止antibiotic-induced阻塞的殖民唇抵抗感染美国沙门氏菌感染生产所需的代谢活动低肠道pH值和有机酸anti-infectious属性是非常重要的。

结论

广泛的分布双歧杆菌spp。在凳子上健康的婴儿和人。分子技术根据放大16 srdna代表特定的识别方法双歧杆菌属相比,生化试验。双歧杆菌spp。的有效作用,减少了在小鼠感染沙门氏菌病吗美国沙门氏菌感染庆大霉素是无法相比的。

确认

作者感谢谢谢阿卜杜拉博士Obaeis Alhatami(镇大学兽医学院,微生物)提供鼠伤寒沙门氏菌隔离。

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