甲状旁腺激素中蛋氨酸、色氨酸和组氨酸氧化机制及稳定性的建模

摘要

最近单克隆抗体候选人的氧化事件促使我们研究Met, Trp和His残基的氧化机制，并寻找合适的稳定剂。通过甲状旁腺激素(1-34)，甲状旁腺，作为一个模型蛋白质和各种氧化剂，通过液相色谱、肽图谱和质谱的辅助，我们鉴定并定量了这些脆弱残留物的氧化。H2O2和t-丁基过氧化氢(t-BHP)主要氧化两种Met残基，2,2 ' -偶氮吡啶(2-氨基丙烷)二盐酸盐(AAPH)和H2O2+Fe(II)氧化Met残基和色氨酸残基，其中AAPH更能产生氧化色氨酸物种而不是后者。H2O2+Fe(III)产生的结果与H2O2+Fe(II)产生的结果相当，除了羟基化Phe的数量较少。

关键词:

氧化;高效液相色谱法;质谱;自由基;稳定;赋形剂;甲状旁腺素;色氨酸;Trolox;吡哆醇

描述

最近单克隆抗体候选人的氧化事件促使我们研究Met, Trp和His残基的氧化机制，并寻找合适的稳定剂。通过甲状旁腺激素(1?34)， PTH，作为一个模型蛋白质和各种氧化剂，通过液相色谱、肽图谱和质谱的辅助，我们鉴定并定量了这些脆弱残留物的氧化。而H2O2和t-丁基过氧化氢(t-BHP)主要氧化这两个Met残基，2,2?-azobis(2- amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)和H2O2+Fe(II)氧化Met和Trp残基，其中AAPH更能产生氧化Trp物种而不是后者。H2O2+Fe(III)产生的结果与H2O2+Fe(II)产生的结果相当，除了羟基化Phe的数量较少。当用铜代替铁时，甲状旁腺素中的His残基发生氧化。AAPH是一种自由基产生剂，它产生烷基过氧化物，模拟氧化过程物种从降解的聚山梨酸酯中提取，通常在蛋白质配方中发现。使用H2O2、H2O2+Fe(II)和AAPH筛选稳定剂是谨慎的，因为这些剂分别代表了降解聚山梨酸酯中常见的H2O2、无菌剂的残留物和不锈钢表面的金属以及降解聚山梨酸酯中的烷基过氧化物的潜在侵害。

蛋白质的氧化作用

氧化是制药产品中蛋白质的主要化学降解途径之一。Lietal等人已经对这个主题进行了综述。半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)和酪氨酸(Tyr)残基的侧链易于氧化。Cys中的巯基是反应性最强的官能团;因此，很少有药物蛋白含有游离Cys。在本报告中，不讨论Cys氧化;相反，我们打算关注Met, His和Trp的氧化。氧化的另一个方面，光氧化，也将排除在本讨论之外。

选择模型蛋白质
选择甲状旁腺激素是因为其最小的三级结构和它的序列，它包含所有三个理想的氨基酸(一个Trp，两个Met和三个His)。氧化的另一个方面，光氧化，也将排除在本讨论之外。它可以通过反相高效液相色谱法进行分析。

(高效液相色谱);以及它的可用性。当朱等人。研究了仅H2O2胁迫下甲状旁th中Met的氧化，发现Met8和Met18的不同氧化速率与2层水配位数有关。差异<1.5倍，不足以影响我们从研究中得出的结论。不同Met残基的氧化速率生长激素主要归因于不同程度的溶剂暴露。我们期望完全溶剂暴露的Met在甲状旁腺激素、生长激素和rhVEGF中的氧化速率是相当的。因此，PTH上的两个Met残基可以模拟所有蛋白质中溶剂暴露的Met。由于只有一种色氨酸的存在，所以易于LC/MS分析模型我们研究的蛋白质。人们应该认识到，甲状旁腺激素的结果不能完全模拟复杂蛋白质(如单抗)的氧化蛋白质结构对残留的速率和范围施加影响。
这项研究不同于先前关于甲状旁腺激素在氧化条件使用方面的工作。先前的研究只使用过氧化氢，而本研究中使用的条件允许色氨酸和苯丙氨酸被氧化和观察。Met and Trp Oxidation in PTH显示PTH与H2O2反应的反相高效液相色谱图，其中Met18[O]-PTH, Met8[O]-PTH，以及双重氧化的PTH物种被检测到;经LC/MS鉴定。反应条件，pH值5和40