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，卷:16(3)DOI: 10.21767/0972-768X.1000285

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胆碱和一些营养油对大鼠肝脏和心脏组织诱导的NAFLD障碍的调节

*通信:

Haidy G Abdel-Rahman，埃及伊斯梅利亚苏伊士运河大学兽医学院临床病理科，电话:+ 201207059063;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

不含酒精的脂肪肝(NAFL)参与心血管风险的进展。像胆碱这样的增脂因子可以防止肝脏中过多的脂肪堆积。大蒜洋葱含有大量的硫化合物。本研究探讨了胆碱、洋葱和洋葱的保护作用大蒜高脂饮食对大鼠肝脏和主动脉组织的影响。42只雄性白化大鼠随机分为6组;每只7只，饲养2个月。对照组;对照组，F组;脂肪饮食，f -胆碱组;含胆碱脂肪饲粮(3 gm/100 g饲粮)、F-OO、F-GO和F-mix组;并补充洋葱油(100 mg/Kg B.W)，大蒜油(100毫克/公斤B.W)和两种油的组合。f组显著增加体重、肝脏重量、血脂、肝脏和心脏生物标志物、瘦素激素血清HDL-C、总蛋白、白蛋白、TNO、脂联素及组织MDA水平显著降低抗氧化剂与对照组比较。此外，与未处理的脂肪组相比，处理过的脂肪组在所有测试参数上都有显著改善。总之，洋葱和大蒜油脂组合对高脂血症大鼠具有显著的降血脂、抗氧化和抗动脉粥样硬化作用。

关键字

非酒精性脂肪肝;胆碱;葱油;大蒜油;抗氧化剂;血脂

简介

不含酒精的脂肪肝(NAFL)是指在没有摄入酒精的情况下，肝脏积聚了过多的脂肪[1］．NAFL的进展与胰岛素抵抗有关，肥胖以及高脂血症[2］．高脂血症是一种或多种血脂的增加，包括甘油三酯(T. Gs)、胆固醇、胆固醇酯磷脂或血浆脂蛋白，包括极低密度脂蛋白(VLDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)，以及高密度脂蛋白(HDL-C)水平下降[3.］．心肌疾病与LDL-C、VLDL-C水平升高呈正相关，与HDL-C呈负相关。其中，HDL-C阻止LDL-C摄取到血液中，并有利于胆固醇运输到肝脏分解和排出体外[4］．

高胆固醇饮食被认为在各种心脏疾病的进展中起着根本作用，因为它会导致高脂血症的发展，使心脏无法调节任何氧化性心肌压力［5]是动脉粥样硬化和心血管疾病的主要危险因素，导致超过80%的死亡[6］．有些化合物可以消除肝脏中多余的脂肪，称为增脂因子，如胆碱，其化学性质类似于b族维生素。胆碱进入细胞膜线粒体也可以防止肝脏脂肪的堆积[7］．它还可能有助于降低胆固醇和同型半胱氨酸水平，这些水平与心血管疾病和某些类型的癌症有关[8］．

营养食品是天然食品，可以保护细胞免受氧化引起的各种疾病压力通过促进细胞的内源性抗氧化状态[9］．富含水果和蔬菜的饮食可以降低患某些疾病的风险，如冠状动脉疾病和一些类型的癌症［10］．洋葱(Alliiumcepa L)和大蒜（大蒜)属于家庭百合科，广泛用作药用植物。它们含有大量多酚类和有机硫化合物，主要以半胱氨酸衍生物的形式存在[11］．此外，对肥胖、高脂血症、心血管疾病及糖尿病亦有良好的治疗作用[12］．洋葱含有黄酮类化合物，尤其是槲皮素，它是一种强抗氧化剂，能清除大鼠体内的活性氧代谢综合征［13］．大蒜已被证明可以通过其多不饱和脂肪酸恢复由高胆固醇饮食引起的不良血脂状况[14］．对于高脂血症患者来说，了解这些药物的安全性和有效性是很重要的，目前的研究是为了评估胆碱、洋葱油、大蒜油和两种油的组合在改善高脂肪饮食对白化病大鼠的有害影响，通过评估体质量和肝脏重量，血脂和肝脏和心脏功能的一些生化生物标志物。此外，肝脏和心脏组织氧化压力肝脏和主动脉组织病理学检查。

材料与方法

化学品和保健油

氯化胆碱-(2-羟乙基)三甲基氯化铵-采购自印度LOBA Chemie。洋葱和大蒜石油是由埃及开罗El-Captain公司从当地市场采购的商业产品。血脂谱参数试剂盒来自法国ELITech diagnostics公司。肝转氨酶(ALT和AST)购自英国Randox实验室有限公司。乳酸脱氢酶(LDH)、CK-NAC和CKMB试剂盒均取自Diagnosticum Zrt。，匈牙利布达佩斯。总蛋白和白蛋白采购自埃及Biodiagnostic公司。采用ELISA试剂盒检测血清瘦素、脂联素和H-FABP (KAMIYA Biomedical Company, USA)。TNO试剂盒来自美国开曼化学公司。丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒来自美国BioVision公司。

气相色谱-光谱法分析(gc - ms)

GC-MS分析参照Packia等[15]根据郭等人的说法。[16]大蒜油，采用Trace GC Ultra-ISQ质谱仪(Thermo Scientific, Austin, TX, USA)，直接毛细管柱TG-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm膜厚)。

动物和实验方案

雄性白化大鼠42只，体重90 ~ 120克，来自埃及开罗Pharco制药公司。它们被饲养一周以适应环境。这项实验是在苏伊士运河大学兽医学院的动物馆进行的。在环境条件(20°C，相对湿度55-60%)下，光/暗循环12 h的笼内饲养。本研究遵循了机构动物护理指南，并获得了埃及苏伊士运河大学兽医学院研究伦理委员会的批准(批准号2018乐动KENO快乐彩058)。将大鼠随机分为6组，每组7只。试验期2个月。实验期间，处理方案如下:I组(对照组):饲喂基础饲粮[17) (表S1)．第二组(F组):未经处理、以高脂肪饮食喂养的肥胖大鼠[18) (表S2)．III组(f -胆碱):大鼠饲喂脂肪饲料，并添加氯化胆碱，剂量为3克/100克饲料[19］．IV组(F-OO):大鼠喂高脂饲料，加洋葱油，按100 mg/Kg体重灌胃[20.］．V组(F-GO):大鼠喂高脂肪食物，并补充大蒜按100毫克/公斤体重灌胃[20.］．VI组(F-Mix):大鼠喂高脂肪食物，并补充洋葱和洋葱大蒜IV组和V组灌胃给予相同剂量的油。

表S1:对照组的基础饲粮组成如Qamar等所述，[17］．

表S2:脂肪喂养组的日粮组成按Axen和Axen描述[18］．

血清和组织样本

在实验的第二个月结束时，大鼠称重，然后在采血前挨饿12小时。麻醉大鼠后眶后静脉丛注射50 mg/kg B.W戊巴比妥钠I/M，取血样，置于普通离心管中凝血，3000 rpm离心10分钟，小心收集清血清，-20℃保存，待脂质、肝心功能生物标志物及各项生化指标评估。采血后处死大鼠;切除肝脏、心脏和腹主动脉。称量肝脏，取一块肝脏及主动脉固定于10%中性缓冲福尔马林中进行组织病理学检查。另一片肝脏和心脏保存于-80℃，进一步测定SOD活性、GSH和MDA水平。

血清生化试验

参照Rivellese等方法测定血清总胆固醇(TC) [21]，甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL-C)根据Tietz [22]，低密度脂蛋白(LDL-C)和非常低密度脂蛋白(VLDL-C)由Davidson和Rosenson描述的公式计算[23]、谷丙转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST) [24]，乳酸脱氢酶[25]，总蛋白(TP) [26]、白蛋白[27]，瘦素[28]和脂联素激素根据制造商的说明。血清Ck-NAC的估计方法如Mathieu [29]及CKMB [30.]， h-fabp [31]及TNO [32］．

肝、心组织脂质过氧化及抗氧化标记物测定

部分肝脏和心脏组织浸泡在冰冷的生理盐水中，用组织匀浆机均质。匀浆在4°C下以7000 rpm离心20分钟。组装上清液并用于抗氧化分析，如下所示:MDA被评估为肝脏和心脏组织脂质过氧化的标志，如Kei [33］．评价组织中酶促抗氧化活性;SOD根据Nishikimi等人[34］．组织中非酶抗氧化水平;GSH是Beutler等人做的[35］．

组织病理学检查

肝脏和腹主动脉标本立即用10%福尔马林固定。标本固定后，乙醇脱水，二甲苯清除，石蜡包埋，苏木精、伊红染色[36］．

统计数据

所得数据的所有统计分析(Mean±SE)均使用SPSS 20版本for windows (SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州)进行。通过邓肯事后检验的单因素方差分析。P值≤0.05为组间显著性。

结果

gc - ms分析

洋葱油:洋葱油中DADS、十二烷、2,6,10-三甲基、三硫化甲基- 2-丙烯、2-溴十二烷、3-乙烯基-[4H]-1,2-二稀和十四烷、2,6,10-三甲基的化学成分分别为0.60%、0.88%、0.44%、0.30%、0.67%和0.57%。

大蒜油:的化学成分大蒜油DADS、2,2 -二氘-十八烷、油酸、1,54 -二溴四戊acontane、多三戊acontane和异山茱素B的含量分别为0.60%、3.03%、2.58%、4.80%、10.99%和2.61%。

体重和肝脏绝对重量

如表1与对照组相比，f组体重和肝脏绝对重量显著增加(P≤0.05)，而各脂肪处理组与f组相比，体重和肝脏绝对重量显著降低(P≤0.05)。脂肪处理组与对照组的体重和肝脏绝对重量无显著差异。

表1:对照组和实验大鼠在2个月时记录体重和肝脏绝对重量。

血脂谱

f组血清TC、TG、LDL-C、VLDL-C水平较对照组显著升高(P≤0.05)，HDL-C水平较对照组显著降低(P≤0.05)。另一方面，与f组(表2)．

表2:对照大鼠和实验大鼠2个月时测定血脂谱。

血清肝和心功能生物标志物

与对照组相比，f组大鼠血清肝转氨酶(AST、ALT)、LDH、CK-NAC、CKMB活性及H-FABP水平显著升高(P≤0.05)，TP、白蛋白、NO水平显著降低(P≤0.05)。脂质处理组与f组相比，AST、ALT、LDH、CK、CKMB活性和H-FABP水平显著降低(P≤0.05)，高蛋白血症、高蛋白血症显著降低(P≤0.05)，NO水平升高(P≤0.05)。表3)．

表3:对照组和实验组在2个月时测定血清肝、心功能生化指标。

血清瘦素和脂联素水平

如表4与对照组相比，f组瘦素水平显著升高(P≤0.05)，脂联素水平显著降低(P≤0.05)。而f -胆碱、F-OO、F-GO和F-Mix均显著降低瘦素(P≤0.05)激素并增加脂联素激素与f组相比

表4:对照组和实验组在2个月时测定血清瘦素和脂联素水平。

肝和心脏组织脂质过氧化和抗氧化状态

高脂饲料组大鼠肝脏和心脏组织出现脂质过氧化，MDA水平明显高于对照组(P≤0.05)。而其他组的大鼠则提供膳食补充剂与f组相比，高脂饮食显著降低MDA水平。而与未处理f组相比，各处理脂肪组大鼠肝脏和心脏组织中SOD活性和GSH水平均显著升高(P≤0.05)，从而提高抗氧化能力(表5)．

表5:不同试验组2个月时肝脏和心脏组织脂质过氧化和抗氧化状态。

组织病理学结果

肝:对照组肝脏组织学结构正常，肝小叶大小形状与正常门静脉区相同。每个小叶都有位于中央的中央静脉和肝细胞的放射柱。肝细胞呈六边形，具有丰富的嗜酸性细胞质和位于中央的嗜碱性细胞核。肝窦正常(图1一个)．f组大鼠肝内均有不同程度的脂肪浸润细胞以肝细胞内未染色的空泡为代表。液泡形状大小不一，有的合并形成大液泡。一些病例在肝周围和一些充血的中央静脉周围出现炎症反应，并伴有纤维结缔组织增生(图1 b)．纤维组织从门脉区向另一门脉区延伸(门脉-门脉，II级)。f -胆碱组肝脏肝细胞可见轻度至中度脂肪浸润，肝周围可见淋巴细胞局灶浸润，巨噬细胞较少(图1 c)．F-OO大鼠肝脏周围出现轻度至中度脂肪浸润和局灶性白细胞浸润(图1 d)．F-GO大鼠肝细胞内脂肪浸润明显减少，肝周围出现多灶性明显炎症反应(图1 e)．F-mix大鼠肝脏功能明显改善细胞轻度空泡伴肝周围多处白细胞灶(图1 f)．

动脉:对照组主动脉三层组织结构正常，分别为面向管腔的扁平内皮细胞组成的内膜、由平滑肌和弹性纤维组成的中膜和由胶原纤维组成的外膜(图2一个)．f组各组主动脉壁纤维肿胀，弹性纤维明显增厚，平滑肌局灶性透明化，局灶性嗜碱性沉积，内膜下有明显空泡(图2 b)．f -胆碱组主动脉轻度肿胀，脂肪空泡分布(图2 c)．F-OO组中膜轻度至中度增厚，空泡化，内膜不连续(图2 d)．F-GO组脂肪沉积明显减少，肌肉透明化程度降低(图2 e)．F-mix组对脂肪饮食有明显改善和保护作用(图2 f)．

讨论

高脂饮食、超重、吸烟、酗酒、缺乏运动等不健康的生活方式会导致胆固醇水平异常和自由基的释放。洋葱和大蒜富含一些必需脂肪酸和一些生物活性化合物在脂肪代谢中起着重要作用消除自由基的。一些发展中国家非常需要这些效果;由于饮食不平衡而导致的多种疾病，富含饱和脂肪。这一结果与Hooper等人的结果一致。[37］．同时，与F组相比，脂肪处理组的体重明显下降。因为胆碱对脂肪有分解作用，导致整体体重减轻[38］．洋葱和大蒜含硫化合物有抗肥胖作用[39］．所得数据与El-Demerdash等人的结果一致。[40］．

脂质水平升高及其积累可诱发冠状动脉粥样硬化[41]通过在大动脉和中动脉管壁内形成纤维斑块[42]，导致向心肌供血的动脉变窄，限制血液流动，产生的氧气不足以满足心脏的需要。在本研究中，f组表现为脂质紊乱。其中，LDL-C对脂质过氧化易感性增加，会导致LDL-C氧化和动脉粥样硬化的发生[43］．

血清TG的升高可能是由于肝脏VLDL的产生和分泌增加，肝脏从头脂肪酸合成增加，抑制脂肪酸氧化和脂蛋白脂肪酶降低[44］．此外，由于激活3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a (HMG-coA)还原酶，TC水平升高[45］．另一方面，膳食补充剂显示血脂水平显著改善。如前所述，磷脂酰胆碱(PC)可通过β-氧化促进脂肪酸分解代谢[46]，活化胆汁酸合成[47］．OO有降脂的作用，由于各种生物活性化合物包括槲皮素，通过抑制二酰基甘油酰基转移酶和乙酰辅酶a羧化酶活性来减少三酰甘油和VLDL的形成[48］．此外，氧化石墨烯通过降低肝脏HMG-CoA还原酶、胆固醇7α-羟化酶、戊糖-磷酸途径活性而显著降低LDL-C水平[49]，胆汁酸分泌增加[50]及抑制肝脏脂肪酸合成[51］．这种减少可能是由于二烯丙基二硫化物(DADS)的存在大蒜［52］．大蒜可以通过抑制LDL-C氧化表达抗动脉粥样硬化活性。综上所述，TG水平的降低可能与刺激作用有关大蒜关于脂肪酶[53］．而洋葱和大蒜石油组合;有利地引出了高脂饮食对血脂的不良影响，因为高含有机硫化合物，从而表现出降血脂的作用。组织病理学观察证实了这些结果。

高脂饮食对血清肝脏和心脏生物标志物有不良影响，肝脏转氨酶、LDH、CK-NAC和CKMB活性和H-FABP水平升高，总蛋白、白蛋白和NO水平降低。这些结果与Panchal等人的结论一致。[54]和Faloppi等人。[55］．类似地，Amin和Nagy [56]记录了高脂饲粮大鼠血清ALT、LDH、CK-NAC和CK-MB活性显著升高。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是肝细胞损伤后释放到血液中的细胞质酶[57］．因此，总蛋白和白蛋白水平的降低可能是由于肝细胞损伤导致的合成减少[58]或压力因为高脂肪饮食会增加身体对ROS的中和需求[59］．同样，AST、LDH和CK是心肌细胞中的胞浆酶，在细胞损伤时进入循环，是心肌疾病的诊断工具[60，61］．H-FABP是一种蛋白低心肌细胞细胞质中的分子质量，被认为是心肌严重损伤的敏感指标[62］．H-FABP调节心肌细胞内脂质转运，从而调节代谢状态[63］．NAFLD记录血清H-FABP水平升高[64]，这可能是亚临床心肌损伤。

另外，与f组相比，处理过的脂肪组降低了估计的标记酶的活性，表明胆碱，洋葱和大蒜对ROS具有抗氧化作用，从而通过保存防止肝酶泄漏到循环中细胞膜稳定(57］．此外，胆碱是形成PC所必需的营养素，而PC对细胞膜的完整性是必要的[8］．Veenema等[65]指出，摄入足够的胆碱足以防止乳酸脱氢酶升高。我们的结果与Hanaa等人的结果一致。[66]， Marcolin等人。[67]和Nabila [68他们推断肝转氨酶活性显著降低大蒜分别补充油、胆碱和洋葱。此外，治疗组总蛋白和白蛋白水平的升高可能归因于它们对ROS的抗氧化作用，因此它们改善了合成蛋白质和白蛋白的肝功能[69-71］．

一氧化氮是在血管内皮层合成的，对周围的平滑肌有放松作用，导致血管扩张和增加血液流动。关于高脂肪饮食的不良影响，费迪南德等人。72]的研究报告显示，持续食用高胆固醇饮食可导致心脏NO水平下降。同样，Giricz等人[73]和Ónody等。[74]报告高脂血症组大鼠心脏NO含量降低，因为高脂血症导致心脏NO含量降低压力因为一氧化氮代谢紊乱。其中，内皮NO合成酶(eNOS)不稳定产生，导致NO生成降低，内皮损伤[75］．黄等人。[76]的研究表明，高脂饮食喂养的瘦雌性朱克大鼠NO生物利用度降低可能是由于l -精氨酸产生的NO减少或ROS超氧化物氧化NO。此外，由于eNOS磷酸化受阻，低脂血症导致NO生成减少[77］．此外，膳食中补充胆碱和营养药品可提高NO的生物利用度，这与Predmore等人的研究结果一致。[78］．大蒜能增加正常人类志愿者体内NO的产生[79]和槲皮素已被证明可提高NO的生物利用度[80，81］．

脂肪细胞分泌的脂肪因子在胰岛素抵抗状态下浸润脂肪组织;在NAFLD中起作用发病机理这与心血管疾病有关非酒精性脂肪肝发病机理包括高瘦素血症由于增加释放细胞因子如IF-γ， TNF-α和TGF-β1 [82］．此外，脂联素促进脂肪氧化并使原始脂肪酸合成最小化[83］．NAFLD记录低脂血症，导致肝细胞脂肪代谢异常和脂肪堆积[84］．在本研究中，f组与对照组相比，血清瘦素水平显著升高，脂联素水平显著降低。Gnacinska等人[85]推断瘦素浓度与肥胖以及体重的变化。而Lihnet等人[86指出脂联素与肥胖指标呈负相关。膳食补充剂改善了体重，因此提高了瘦素和脂联素的水平激素并阐明具有抗肥胖作用，其中胆碱可促进脂肪酸β-氧化[46，87］．槲皮素和大蒜含硫化合物具有抑制抑郁的抗肥胖作用肥胖［48，88］．

肝脏和心脏组织氧化压力在高脂饮食喂养的大鼠中表现明显，而在其他组的饮食中添加天然产物可以改善高脂饮食诱导的氧化效应。根据Ónody等。[74他提到，与对照组相比，胆固醇喂养的大鼠血浆丙二醛显著增加。同样，Otunola等人。[14在高胆固醇血症大鼠中观察到氧化作用，其表现为MDA水平升高，肝脏、肾脏、心脏和大脑组织中的抗氧化酶受到抑制，并报告补充香料提取物后MDA水平降低，抗氧化酶活性恢复。在预防心血管疾病方面，普遍食用ROS比限制食用脂肪饮食更有效[89］．线粒体功能障碍参与发病机理包括脂质氧化损伤和过氧化氢生成的诱导[90］．

结论

目前的研究概述了一些生物化学途径的贡献发病机理非酒精性脂肪肝。然而，其中许多途径的细节仍有待阐明;它为NAFLD的未来治疗策略提供了靶点，并强调了它们对防止动脉粥样硬化的影响。特别是营养药品的保护作用;洋葱和大蒜对NAFLD对肝脏和心脏活动的不利影响进行了研究。洋葱和大蒜在喂食高脂饮食的大鼠中，与单独服用每种补充剂相比，联合服用被证明具有协同和有效的降血脂、抗氧化和抗动脉粥样硬化影响。

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