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最佳Enzyme-Assisted乙醇提取西兰花RSM和类黄酮的抗氧化作用研究

*通信:

Hui-duan L化学和生命科学,楚雄师范大学,楚雄,675000年,中国,电话:+ 86-878-3100507
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文摘

Enzyme-assisted乙醇提取总类黄酮西兰花和研究其抗氧化效果,进行了研究。酶浓度、固液比、提取温度和时间被确定为四个单因素实验。根据单因素实验结果,进一步优化了提取过程RSM和Box-Benhnken设计。最优提取条件下酶的浓度0.15%,固液比5:30 (g / mL),提取温度70°C和2 h,相对应的实验反应萃取率为0.935% 0.953%的理论预测。匹配实验萃取率与理论值通过求解多元回归方程。RSM已被证明是一种有效的技术来优化提取工艺及二次安装模型预测影响目标提取。西兰花提取物对羟基自由基的清除作用表现出明显的量效关系。

关键字

Enzyme-assisted乙醇提取;响应面方法;Box-Benhnken设计;西兰花;酶;抗氧化作用

介绍

黄酮类化合物是天然多酚抗氧化剂anti-peroxidation带来深远的影响和自由基清除。类黄酮有显著的抗氧化,抗癌,消炎,杀菌,抗病毒和调节身体免疫力,等等。1- - - - - -4]。的提取技术类黄酮报道的文献包括有机溶剂提取、超声波提取、微波萃取、超临界流体萃取和Enzyme-assisted提取5- - - - - -6]。

响应面方法(RSM)是一个包含多个变量的统计方法来解决问题。多个二次函数是通过合理的实验设计,以适应因素和响应值,并确定最优工艺参数通过分析回归方程。RSM优势缩短实验周期,回归方程精度高,多种因素之间的相互作用等。7]。RSM证明是一个有效的统计技术来优化复杂流程,已成功地用于优化的提取类黄酮从许多医学植物(8,9]。总类黄酮萃取率大大影响提取条件;Box-Behnken设计进行预测的最优提取条件(10]。

有相关报道从西兰花在文献中提取黄酮总量的11- - - - - -13]。周et al。11]报道RSM总黄酮的提取西兰花。所报告的最佳提取条件是乙醇浓度为90%,固液比为1.0:30 (g / mL),和提取温度为85.28°C和时间为1.82 h反应萃取率为0.853% (11]。陈和施12,13报道超声和纤维素酶辅助提取总额的类黄酮从西兰花12,13]。前提取比例是1.128%的乙醇浓度51%的固液比下1.0:20 (g / mL),提取温度53°C和超声功率为201 w。后者提取比例达到了1.251%的酶用量0.84%,酶解pH值5.0和酶解时间的57分钟。

在这里,优化Enzyme-assisted乙醇提取类黄酮从西兰花的RSM和决心类黄酮分光光度法内容的报道。另外,纤维素酶和果胶酶酶辅助提取过程,破坏细胞壁。西兰花提取物的氢氧自由基清除效果也进行了研究。本研究在提供有价值的帮助类黄酮为开发利用西兰花内容数据。

材料和方法

材料

西兰花(在楚雄的农业市场购买)→干燥→粉碎→备用。

实验方法

Enzyme-assisted乙醇提取总类黄酮从西兰花最初是由单因素实验,然后通过响应面分析法优化方法。最后,对羟基自由基清除效果的研究西兰花提取物进行了研究。RSM优化西兰花的实验说明类黄酮其提取物的提取和自由基清除效果所示图1。Enzyme-assisted乙醇提取西兰花,西兰花提取物的显色反应,得到的线性方程组芦丁标准曲线进行根据文献[14,15]。

RSM优化的提取工艺

优化类黄酮提取通过讨论了RSM Zhang et al。16]。Box-Benhnken设计结合二次反应模型四个因素和三个层次进行优化提取。首先,四个单因素决定的独立变量,变量的水平是由1编码的,0、1根据单因素实验结果(表1)。共有29分的设计,其中包括分16个阶乘,中部8星分和5分,以确保实验的精度。

表1。因素和水平的响应面方法。

研究氢氧自由基抑制活动

总类黄酮被RSM首选条件下提取西兰花。纯化的提取物制品离心机宏观多孔树脂,乙醇洗脱(乙醇体积分数80%),溶剂蒸发,冷冻干燥获得的总类黄酮粉。西兰花总类黄酮解决方案与不同浓度的准备。氢氧自由基清除效果操作(16- - - - - -18),西兰花总类黄酮和二叔丁基对甲酚的解决方案添加了与不同浓度的吸光度测量在510 nm,和收集的平均吸光度是平行实验。扫气率计算:

氢氧自由基的清除比率(%)= (₀(一个_x我_x0)/₀×100

一个₀控制溶液的吸光度,_x是西兰花提取物的吸光度;一个_x0是背景没有H吸光度的提取物₂O₂。

结果与讨论

显色反应的西兰花提取物与芦丁是相一致的,也证实了西兰花含有总类黄酮。和西兰花提取物芦丁的吸收光谱的最大吸收波长为510 nm (图2)。线性回归方程被制定为= 3.283 c - 0.009 R²由标准曲线(= 0.999图2)。

每个单因素对萃取率的影响所示图2。最优酶浓度为0.10%的响应提取西兰花的比例为1.984%。萃取率与固液比的增加显著增加,固液比时高于5:30 (g / mL),萃取率开始降低。高于5:30 (g / mL),导致浪费的材料;低于5:30 (g / mL),固液阶段是两个小的浓度梯度,这是不利于总类黄酮的解散。首选的固液比5:30 (g / mL)的响应提取西兰花的比例为4.44%。随着温度增加,萃取率显著增加,最大的提取比例为1.967%,达到70°C。较高的温度会导致乙醇蒸发和类黄酮的氧化变性。较低的温度下降的速度类黄酮解散。所以提取的最佳提取温度为70°C类黄酮从花椰菜。最佳提取时间为3.0 h从西兰花的反应萃取率3.107%。低于2.0 h,溶解平衡并没有实现,高于2.0 h,解散其他脂溶性杂质复杂离婚后和总黄酮类化合物的净化。

根据单因素实验的结果,酶浓度0.05% - 0.15%;固液比为3.0:30 - 7.0 -:30 (g / mL),提取温度60°C到80°C和提取时间为2.0 h - 4.0 h测定作为响应面分析因素和范围。

响应面优化提取工艺

多元回归模型和方差分析(方差分析):的提取过程类黄酮从西兰花被RSM进一步优化。根据3.1的单因素实验结果,酶浓度0.05% - 0.15%;:30固液比3.0 ~ 7.0:30 (g / mL), 60°C到80°C的提取温度和提取时间为2.0 h 4.0 h被选为因素的实际水平最大化提取总额的比率类黄酮通过Box-Benhnken设计,如中列出表1。

总共有25的实验设计,包括16个阶乘实验,8星实验和1中央实验估计绝对误差。

RSM西兰花萃取率的实验设计和结果所示表2。提取比例从1.708%到2.409%不等。被记录的最大萃取率的实验条件下,酶浓度的0.10%;固液比3 (g / mL), 80°C的提取温度,提取时间为3.0 h反应萃取率为2.409%。

表2。实验设计和结果供使用Box-Behnken和RSM萃取率。

分析了实验数据通过使用8.0设计专家,响应变量的提取比例和四个独立变量相关的多重回归方程:

提取比例= 0.038 + 1.99 + 0.074 - 0.12 B + C - 0.029 - 0.071 d - ab - 0.13 - ac + 0.033 - 0.14 B C + 0.020 BD + 0.11 cd - 0.10²+ 0.055 b²-0.022摄氏度²+ 0.098 D²

提取比例= -0.24321 + 28.94275 + 0.31811××酶浓度固液比提取温度- 1.47580 + 0.062812××提取时间- 0.70725××酶浓度固液比- 0.25560××酶浓度提取温度+ 0.65850××酶浓度提取时间- 6.78750 - e - 003×固液比提取温度+ 9.90000 e - 003××固液比×提取时间+ 0.010590 - 40.05000×××萃取温度提取时间酶浓度²+ 0.013641×固液比²-2.23500 e - 004×萃取温度²+ 0.098363×提取时间²

表3显示,方差分析(方差分析)的多重回归方程模型f值3.45意味着模型是显著的。只有2.75%的机会,”模式f值”这个大可能是由于噪音。“概率> F”的值小于0.0500模型条件是重要的。在这种情况下,线性项的固液比和固液比、提取温度的交互项显著的响应变量。值大于0.1000表示模型条款并不重要。如果有许多微不足道模型条款(不包括那些需要支持层次结构),模型减少可以提高您的模型。

表3。为响应面方差分析二次模型西兰花。

ANVOA表示响应变量的分析结果和四个独立变量不是一个简单的线性关系。R的值²(0.8248)和R_邻接的²(0.5883)的多重回归方程并不接近,表明模型需要进一步优化。足够的精度值为7.584的可取的价值远高于4.00,这提出了一个更高的“信号(响应)噪声(偏差)”,表示模型重要的萃取过程,P值模型是小于0.05。这模型可以用来导航的设计空间。的低价值系数的方差(简历= 5.86%)也表示,模型有一个可预测的效果总黄酮类化合物的提取工艺。

方差分析的结果(方差分析)表明,显著水平的四个因素是按固液比>酶浓度>提取温度>提取时间。固液比的线性项和固液比、提取温度的交互项显著的响应变量。

RSM分析和研究最优提取过程:多元回归模型可以生动地反映三维响应面和等高线图,如图所示图3- - - - - -8。三维响应面图反映了多个独立的变量对响应值的影响,响应值的敏感性不同的因素也可以分析。相应的表面更陡峭,表示非常重要对响应值的影响。曲线越接近中心的等高线图,对应的响应变量的值越大;等值线与圆表示弱独立变量之间的相互作用,与椭圆形轮廓线表示强相互作用。增加了每个独立变量导致了响应变量的初始增加然后减少。

说明在三维响应面块图3,相应的表面比酶浓度、固液比陡表示其显著影响响应值。小跑等值线显示弱相互作用两个方面对响应值的影响与p值为0.2571。的最大萃取率2.409%是实现酶的浓度0.13%和固液比为3.0:30 (g / mL)。

交互的酶浓度和提取温度对响应值显示在三维响应面块图4,前学期萃取率的影响比后者更有意义。等高线图接近椭圆形,表示交互上述两项对响应值的影响开始显著,P = 0.0550。得到的最大萃取率2.409%,0.13%的酶浓度和萃取温度为79.7°C。

酶浓度对响应值的影响更多的意义比萃取时间,如图所示图5。等高线图还表示上述两项的弱相互作用效应的响应值P = 0.5882。得到的最大萃取率2.409%,酶浓度为0.13%,提取时间为3.8 h。从三维响应面块图6、固液比、提取温度的影响方面的萃取率为响应值显著,p = 0.0438。Oval-like等高线图表示意义相互影响以上两项的响应值。实现的最大萃取率为2.409%的固液比3 (g / mL)和提取温度为79.7°C。

三维响应面和等高线图的交互固液比和萃取时间对萃取率的影响所示图7上述两个条件的相互影响都不显著。而固液比的线性意义影响提取比例从陡峭的表面。的最大萃取率达到2.409%。线性和交互提取温度和时间对萃取率的影响没有意义的三维响应面和等高线图图8。的最大萃取率2.409%提取温度下实现了79.7°C和时间为3.8 h。

所选变量的最优值是通过解决多元回归方程。获得的值= 0.13%,B = 3.0:30 (g / mL), C = 79.7°C和D = 3.8 h,与相应的提取西兰花的比例为2.409%,计算设计专家8.0软件。在这项实验中,三个一式三份实验进行优先提取条件下酶的浓度0.10%,固液比3 (g / mL), 80°C的提取温度和时间为2 h。萃取率为2.409%的平均最大值花椰菜。获得的实验数据中列出表4,实验提取比例和计算值的响应变量彼此吻合很好,表明模型是可靠的西兰花的提取工艺。

表4。获得的实验数据更喜欢实验条件下萃取率。

研究氢氧自由基清除活性

的类黄酮化合物对氢氧自由基清除效果,超氧化物自由基和•DPPH自由基的o-dihydroxy苯环结构(14- - - - - -16]。氢氧自由基清除效果的西兰花提取物、芦丁和二叔丁基对甲酚与不同浓度测定和上市图9随着浓度增加,羟基自由基清除率增加,显示出明显的量效关系。氢氧自由基清除效果的三个相同的抗氧化剂浓度被二叔丁基对甲酚>芦丁年代>排序西兰花提取物。原因分析如下:首先,从苯o-dihydroxy环部分甲基化,从而减少氢氧自由基清除活动(16- - - - - -18]。第二,缺乏必要的分离提取和识别,和杂质的存在也影响了他们的清除效果。

结论

RSM和bdd被成功用于优化enzyme-assisted提取类黄酮从花椰菜。固液比的线性项,交互项的固液比、提取温度、显示显著影响萃取率的响应值。实验中心分Box-Benhnken设计选择。进一步优化了提取工艺RSM和Box-Benhnken设计。最优提取条件下酶的浓度0.13%,固液比为3.0:30 (g / mL),提取温度为79.7°C和时间为3.8 h最大提取比例为2.409%通过求解多元回归方程。匹配实验萃取率的计算值,表示拟合二次的预测效果模型在目标提取。提取物对羟基自由基的清除活性表现出明显的量效关系。的分离、纯化和结构鉴定西兰花提取物、类黄酮的抗氧化活性与结构之间的关系,相关研究工作正在进行中。

确认

作者承认金融支持国家大学生创新创业训练计划(16449)和云南的大学生创新创业训练计划教育部门。

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