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通过中心复合设计优化蜡样芽孢杆菌P5产碱性蛋白酶培养基组成及物理参数

*通信:

普拉摩达·库马里
微生物学系
S.V.大学，蒂鲁帕蒂，美联社，印度
电话:0877 - 2289547
电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

增强碱性培养基的优化蛋白酶用蜡样芽孢杆菌P5进行生产研究。采用中心复合设计对培养基成分进行优化，研究果糖、牛肉提取物、培养时间和pH等4种培养基成分的影响。试验结果表明，最优培养基变量为果糖2.8%、牛肉提取物1.5%、培养时间72 h、pH 9.0。的模型灵敏度高，测定系数为0.94。通过实验验证了该方法的灵敏度模型观测值与CCD得到的预测值基本一致。酶产率在72 h时提高到1538 U mL−1，酶产率增加了1.64倍。

关键字

碱性蛋白酶;蜡样芽胞杆菌；CCD;优化;响应面法

简介

碱性蛋白酶是一种重要的商业酶，在蛋白质水解中起着特殊的催化作用。芽孢杆菌属含有许多重要的工业物质物种并应用于碱性工业生产蛋白酶在极端pH值和温度下[1］．Deepti Jain推断出芽孢杆菌菌株在宽pH值范围、温度(20°C至80°C)和盐度高达20%的情况下具有功能活性。细胞外蛋白酶生产微生物受介质组成、碳源和氮源变化的影响很大[2，3.］．溶解氧、温度、pH值和孵育时间等物理因素也会影响产量蛋白酶生产(4］．介质组成对细胞外有很大影响蛋白酶每一种微生物的产生和作用都是不同的;生长介质的成本估计约占生产成本的30%至40% [5］．介质组分及其组成必须优化。由于采用统计方法的数量优势，采用的方法[6，7］．统计实验设计的应用有增长的趋势生物技术流程。使用统计方法进行了一些微生物优化的研究蛋白酶生产。显然，这些方法可以快速、廉价和准确地确定优化条件。采用响应面法(RSM)选择培养基组分及其组成，研究pH、温度、孵育期、接种量和孵育RPM等物理参数在什么水平上提高酶产率。响应面方法是一种用于建立经验模型的数学和统计技术的集合，它正在为优化化学品和酶等产品的生产条件而获得一种强大的方法[8］．本研究的主要目标是优化碱性变量的水平蛋白酶雇佣生产蜡样芽胞杆菌P5。本研究采用响应面法对促进酶产的组分(变量)进行研究，以考察果糖、牛肉提取物、pH值、孵育时间等自变量的相互作用效应。

材料与方法

微生物

蜡样芽胞杆菌P5产碱蛋白酶从皮革工业的废水中分离出来。根据生化性质和16S rRNA分析，对该细菌进行了鉴定。将该菌株16S rRNA序列与GenBank中的序列进行BLAST比对，并使用ClustalW方法与NCBI GenBank数据库中检索的序列进行比对。该序列已提交Genbank，登录号为KF758385 (蜡样芽胞杆菌应变P5)。

剂制备

蜡样芽胞杆菌P5在营养琼脂培养基中培养24 h，过夜培养作为产酶接种物。

碱性蛋白酶生产中

接种物转入含有50 mL的Erlenmeyer烧瓶(250 mL)发酵根据实验设计而改变其组成的介质。酶蛋白酶在含有(g/L)果糖-5 g、牛肉精-7.5 g、NaCl-5 g、MgSO的培养基中进行生产₄.7H₂O-5 g, FeSO₄.7H₂o - 0.1 g。将培养基pH调整为10.0。以10%的接种量接种生产培养基，摇箱中，37℃，150 rpm，孵育72h。发酵完成后，将整个发酵液在4℃下以10000 rpm离心15 min，回收清上清作为酶源。

碱性蛋白酶分析

采用Anson法测定蛋白酶活性[9，10用1%的酪蛋白作为底物。将0.2 mL酶液加入0.8 mL底物溶液(1% V/V，酪蛋白，50 mM Glycine-NaOH buffer, pH 10.0)，在60℃下孵育15分钟。加入1 mL 10% TCA停止反应，在4℃下以10000 rpm离心15分钟。将1 mL上清液加入3 mL 0.4 M Na中₂有限公司_3.解决方案。每管中加入0.5 mL福林试剂，在室温下涡流保存30min。在福林- ciocalteau试剂的存在下，使用酪氨酸标准曲线提供了相当于1 μmol酪氨酸的显色(OD为660 nm) [11］．

实验设计

在初步优化实验中选择了不同水平的因子来提高蛋白酶的产量。在初步研究中，发现果糖(%)-X₁，牛肉提取物(%)-X₂，孵育时间(h)-X_3.和pH-X₄这四个主要的变量是否增强了蛋白酶产量(Y)。

响应面法优化产酶工艺

响应面法(RSM)采用全因子中心复合设计(CCD)优化介质和物理参数[12］．响应面方法学(RSM) Box-Behnken由一组经验技术组成，用于根据一个或多个选定的标准，评估一组受控实验因素和测量响应之间存在的关系。对4种独立培养基组成进行了高、低两级评价，分别为+1级和1级。根据设计矩阵筛选出28个组合中的显著性变量，并根据蛋白酶活动。对于变量的选择，使用Design Expert (Stat-Ease, Inc.)来计算设计。采用23-1分数阶乘设计拟合二阶多项式模型这表明需要28个实验来分析。

变量编码值由下式研究:

其中，第i个变量的xi-编码阀门，第i个测试变量的xi-未编码阀门和第i个测试变量的xo -未编码阀门。个别变数的范围及水平载于表1而且表2．进行回归分析，估计响应函数为二阶多项式。

表1:自变量的范围和水平。

表2:由28个实验组成的中心复合设计，用于研究三个实验因子在编码单元中的随观测值。

其中Y为预测响应，βi、βj和βij为回归估计的系数。它们分别表示X的线性、二次和叉乘₁, X₂, X_3.和X₄在回应。

实验模型验证

的统计模型根据给定设计空间中的所有四个变量进行验证。随机采用15个实验组合，研究250ml摇瓶中酶的产酶情况。

结果与讨论

实验按照设计进行(表2)，共28次，每次3次，孵育96 h。CCD实验由预测响应值和观测响应值组成，用于研究四个自变量的影响;果糖、牛肉提取物、孵育和pH值对酶产生的影响(表3)．二阶响应面模型结果以方差分析(ANOVA)的形式(表4)．Fisher F检验[F (13,15)=321.6823]低概率值(p)_模型>F=0.000000)表明回归模型的准确性。效率模型由决定系数(R²)．在本研究中，决定系数(R²=0.94)表明只有5.9%的总变化不能被模型解释。由方差分析计算的回归方程表明，R²值为0.94(>0.75表示模型的准确性)[13］．该方法解释了观察到的反应中94%的变化。调整后的决定系数值(adm . R²=0.88)也很高，可以判断模型的优度。较高的相关系数R(=0.97)证明了自变量之间的良好相关性。R²最好的值应该接近1.0统计模型这四个因素都应该是积极的，并且相互接近。

表3:实验值和预测值。

表4:四因子设计的方差分析。

响应面方法得到回归式(3)，的值蛋白酶生产和变量在编码单位

式中，Y=预测反应，X1、X2、X3、X4分别为果糖、牛肉提取物、孵育时间和pH的编码值。X11、X22、X33和X44分别是果糖、牛肉提取物、孵育时间和pH的主要影响指标。

各系数的显著性由t检验和p值(表5)．t值的幅度越大，p值越小，对应的系数越显著。果糖、牛肉提取物、孵育时间和pH值的一级主效应显著，因为它们各自的p值(px3< 0.0004,px4<0.0001)和二级主效应(px11<0.01和px22=0.015)。结果表明，果糖浓度和牛肉提取物浓度对酶的产率有正向影响。响应面等高线图是一次两个因素的函数，将所有其他因素保持在固定水平(零)，有助于理解两个因素的主要影响和组合影响。这些图可以很容易地从模型中计算得到，其中一个因素所取的值，而第二个因素在给定Y值的约束下变化(例如，从−1到+1，步骤1)。图1-6表明一个变量的各等高线曲线斜率依赖于另一个变量的水平，一个变量的各等高线曲线斜率独立于另一个变量的水平。果糖和牛肉提取物是控制酶和蛋白合成的主要因素低浓度下产酶量最大。将实验数据拟合到公式3中，确定各变量的最优水平为:果糖2.8%，牛肉提取物1.5%，孵育时间72,pH 9.0 [14］．Cheng等人使用果糖和酵母提取物优化碱性蛋白酶生产(946.36 U mL-1)。拉克希米，2016年[11报告优化碱性蛋白酶生产从地衣芽孢杆菌通过使用大米外壳和KNO3 (185.4 U/mL) [15，16］．Bhunia [2的优化条件蛋白酶在摇瓶(315.28 U)中通过RSM进行生产。

表5:多元线性回归分析。

验证模型在摇瓶培养中预测

对生产的统计优化条件进行了验证蛋白酶通过蜡样芽胞杆菌P5菌株用导电摇瓶验证发酵在设计空间中[17］．的模型表明所选的果糖和牛肉提取物的浓度是有限的，因此，应进一步增加其浓度，并用于验证。在最终优化条件下，预测的响应蛋白酶产量为1025 U/mL，在统计优化培养基中观察结果为1538 U/mL (图7)，但在76 h后，酶的产量出现了大幅下降模型优化后的培养基比未优化培养基的酶活(937.48 U/mL)提高了1.64倍。一些研究人员之前报道过蛋白酶芽孢杆菌RKY3产量939u /mL [18]， 770.66 U/mL由曲霉clavatus ES1 (Hajji, 2008)， 796 U mL¹水生芽孢杆菌[19]， 202.7 U mL¹用Microbacterium sp. [20.］．统计实验设计方法的主要用途是确定控制因素的合适范围，以获得最佳响应。采用统计设计的目的是确定介质的浓度组成，确定各因素及其之间的相互作用。酶产率受碳源、氮源等培养基成分的影响，也受pH、温度、溶解氧和接种量等培养条件的影响。

结论

统计实验方法证明对最大碱性是有用的蛋白酶生产蜡样芽胞杆菌P5，在摇瓶培养中比使用未优化的培养基提高约1.64倍的酶活性。在优化条件下，预测的响应蛋白酶产量为1025 U/mL，在统计优化的培养基中，观察结果为1538 U/mL。中心复合设计方法允许研究和探索支持培养基组分浓度变化的培养条件。结果表明，蜡样芽胞杆菌P5菌株由于大批量生产碱性，可用于洗涤剂工业和皮革工业等行业蛋白酶在特定的介质中。预测值与实测值之间有高度的相似性，证明了响应面方法优化碱性工艺的准确性蛋白酶酶的生产。

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