研究
，卷:15(3)DOI: 10.37532/0974-7435.2019.15(3).190

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乳清中Trametes versicolor J5产β-半乳糖苷酶的优化

*通信:

Leandro de Souza Lopes，联邦大学Viçosa，微生物学系Agrícola, Viçosa, MG，巴西，电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

在这项工作中，真菌Trametes versicolor J5在乳清中生长，目的是生产酶β-半乳糖苷酶，这种酶有许多应用，主要在食品工业中。在发酵在48小时内，pH值为8，温度接近30°C为最佳点。在96和120小时的发酵过程中，温度干扰较小，β-半乳糖苷酶产量最高。关于pH值，我们有接近8的值作为96和120小时的理想发酵次了。通过这种方式，Trametes versicolor J5真菌能够在产生β-半乳糖苷酶的乳清中生长，从而降低了该过程的成本，并解决了与消除它相关的问题。

关键字

乳清蛋白;栓菌属多色的;真菌;残留;优化

介绍

通过因子规划和响应面分析进行优化是生物技术领域的常用方法。为了确定处理参数的最佳值，如pH值、温度和曝气量[1-4]，响应面方法(RSM)可以理解为实验计划技术、回归分析和优化方法的组合[5］．它们在产品或工艺开发阶段以及现有产品的改进中非常有用。对于生物技术产品，非常需要研究可以在不损失产量的情况下，以最小的工艺成本增加生产规模的技术[6，7］．

的生物技术已经证明了大规模生产各种蛋白质/酶的许多可能性，这些蛋白质/酶在与制药、食品和工业应用相关的研究中非常重要。β-半乳糖苷酶在食品加工工业中具有潜在的应用价值[8］．这种酶是用来获得乳糖水解物牛奶和乳清用于烘焙产品，饲料和作为各种糖的来源发酵产品。β-半乳糖苷酶用于防止冰淇淋和乳制品中的乳糖结晶。由乳糖转化而成的糖浆用于乳制品和软饮料工业。在制药工业中，它被用来生产无乳糖的产品牛奶适用于乳糖不耐症，无法消化的消费者牛奶乳糖(9，10］．

有使用工业残留物或副产品生产生物技术产品的需求，以最大限度地降低成本，从而生产更容易获得的酶[11-13］．已经进行了一些研究，用农业工业残留物取代碳和氮源，为微生物的生长和β-半乳糖苷酶的生产提供必要数量的这些营养物质。的牛奶乳清被用作生成生物技术产品的底物。乳清占总体积的80% ~ 90%牛奶用于奶酪生产，含有大约55%的牛奶营养素:可溶性蛋白质、乳糖、维生素、矿物质及少量脂肪[14，15]，是微生物生长的丰富介质，并且仍然是乳制品的副产品，经常成为环境问题，因为许多工业将乳清倾倒到河流中[16］．

一些作者采用实验设计方法，然后应用中心旋转复合设计来研究在奶酪血清存在下产生β-半乳糖苷酶的最佳条件[17-19］．因此，这项工作的目的是评估发酵通过中心旋转复合设计(EDCRC)的实验设计和RSM对结果的评价，对担子菌真菌重组乳清生产β-半乳糖苷酶进行了研究。

材料与方法

这项工作是在巴西Ifes-Campus Venda Nova do immigrant - es的研究实验室进行的。

培养液

的栓菌属多色的分离株J5为真菌菌根协会实验室收藏。菌株在含有20 mL马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)的培养皿中25±1°C生长15天。

通过重组血清发酵生产酶

对于酶的生产，我们在生产过程中选取了一些参数进行评价，如温度、麦汁pH值、麦汁中蛋白质浓度等，这些参数与麦汁中的血清浓度绑定，即对乳清粉进行重组，以获得一定浓度的蛋白质。

确定了试验的参数及其最小和最大值:麦汁蛋白浓度(重组血清)，pH值和发酵温度。由于蛋白质的浓度与血清的重建有关，因此，由于溶液的粘度和溶解度，浓度有局限性，蛋白质的增加蛋白质含量使麦芽汁非常粘稠，并形成块状，不允许真菌良好生长。pH值和温度的限制与水的特性有关栓菌属多色的J5真菌。的发酵实验在250 mL Erlenmeyer, 50 rpm的摇床中进行，反应量为120 mL。

实验计划

优化的过程发酵使用中心旋转复合设计(DCCR)的实验设计进行酶的生产。实验设计由Minitab程序生成，选择的参数为:麦汁中的蛋白质浓度(通过重组乳清粉与水)(1.0至1.5%)，pH值(4,8)和温度(25℃至40℃)。实验是在一个完全随机设计的阶乘方案。进行多变量方差分析，然后进行5%显著性的Tukey检验。过程中监测β-半乳糖苷酶的变化反应活性发酵经过48 96和120小时的孵育这些变量的评估水平和值由Minitab程序生成。

酶活性

发酵的麦芽汁用Whatman #1滤纸过滤。滤液为粗提物，用于酶活性测定。

以Orto-nitrofenil beta-D-galactopiranosídeo (ONPG)为底物，测定β-半乳糖苷酶的活性。该方法的溶液体积为:ONPG 2 mL, pH为7.5的Tris-HCl缓冲液50mm，酶粗提物200 μl。混合物在45°C下孵育15分钟。加入0.5 mL 1 M碳酸钠淬灭反应，反应产物为邻硝基苯酚(ONP)发色团，用分光光度计在420 nm处测量，颜色为黄色。β-半乳糖苷酶(U)单位定义为在上述条件下每分钟能释放1 μmol ONP的酶的量。

在这项工作中，从奶酪血清中产生的β-半乳糖苷酶的表达是通过体积酶活性表达的。

结果

β-半乳糖苷酶的活性及生产工艺优化

在发酵持续48小时(图1)，可以评估与所分析的每个参数相关的酶活性的最大生产点。关于pH值和温度，我们将pH值8和温度接近30ºC作为最优点，也就是说，这些点导致感兴趣的酶的最大产量(图1一个)．我们可以观察到，当我们分别将pH值和温度提高到约8°C和30°C时，β-半乳糖苷酶的活性趋于增加。这显示了这两个分析变量之间的直接关系。当对麦汁的pH和浓度变量进行评估时，我们可以验证酶的活性在pH, 8时最大，随着麦汁浓度的增加有下降的趋势(图1 b)．麦汁浓度与温度之间呈显著正相关。从图中可以看出，在30°C的温度下，浓度为1.25%时活性最大(图1 c)．这意味着有可能在麦汁中使用较低浓度的蛋白质，但仍能获得较大的β-半乳糖苷酶产量。

在发酵当我们同时分析pH值和温度变量时，我们证实，当pH值增加到8时，β-半乳糖苷酶的活性增加，并且所分析的温度对这种酶的活性几乎没有干扰(图2一个)．就像发酵20小时后，我们也观察到酶的活性随着pH值的增加而增加，pH值8时酶活性最高，1.25%时酶活性最高(图2 b)．在对麦汁浓度和温度变量的分析中，在底物浓度约1.25至1.50%和温度为20ºC至30ºC时，酶的最大活性。β-半乳糖苷酶在浓度为1和1.75%时活性最低(图2 c)．

在分析pH值和温度变量时发酵在120小时内，在20°C至40°C的温度下，pH为6时酶活性最高。在这种情况下，该变量对研究范围内的酶活性没有显著影响(图3)．这种酶的热稳定性在工业应用中是一个有趣的特点。对于变量、底物浓度和pH，当麦芽汁浓度为1.25% ~ 1.50%时，β-半乳糖苷酶活性在pH 8时再次达到峰值(图3 b)．对于浓度和温度变量，酶活性峰值也出现在浓度为1.25% ~ 1.50%时，温度接近30℃(图3 c)．这种酶合成的模式由栓菌属多色的J5说明了这一点真菌分离物可作为工业生产耐热β-半乳糖苷酶的良好原料。

的栓菌属多色的乳清中β-半乳糖苷酶产量最高(1248 μmol L)¹)在37°C和pH值为3至4的条件下孵育20天后[20.］．这一数值远远高于我们在工作中发现的数值，但除了发酵培养基中使用的乳清外，还添加了其他营养来源，如蛋白胨、酵母提取物和一些矿物质，这些营养素可能有助于真菌的发育，从而在更短的时间内提高产量。

酵母菌分离物的最大酶活性在pH 5.3 ~ 5.5和培养温度29℃~ 31℃范围内[21]，值非常接近于本工作中发现的Trametes versicolor J5，尽管pH 8是具有最高活性的，在pH 6时，与pH 8相比，我们使用更少的底物实现了较高的酶产值。

利用Minitab程序，我们对实验结果进行了预测分析。观察3发酵期间，经验证，在96小时内活性最高，值为0.8795 U mL¹其余时间(48和120 h) β-半乳糖苷酶活性最大值分别为0.80和0.75 (图4)．得到的结果表明，在96 h发酵产生更多的β-半乳糖苷酶。在与k . marxianus在乳清上培养，培养40至50小时后，β-半乳糖苷酶的产量达到了最佳水平[22］．在对该酵母的进一步研究中，经过27小时的培养，β-半乳糖苷酶的产量达到了最佳水平，产量为1.73 IU mg¹，在此期间后不再增加[23]，在较短的时间内达到这种酶的最大产量栓菌属多色的J5。

曲霉属真菌nidulans优化后的β-半乳糖苷酶在35°C和pH 3下孵育10天后，产量最高可达60 U mg-1 [9］．然而，参数的优化是分开进行的，没有考虑它们之间的相互作用，就像在这项工作中所做的那样。β-半乳糖苷酶的分离米曲霉在59℃时活性最大，并在该温度下保持稳定50分钟，在此时间后下降[23］．

讨论与结论

响应面法是确定乳清生产β-半乳糖苷酶最佳工艺条件的有效工具。该酶的最佳生产参数为栓菌属多色的J5 (0.8795 U mL¹)在pH 6、32.5°C条件下，最高浓度为1.25%，持续96 h。利用乳清生产β-半乳糖苷酶不仅可以降低工艺成本，还可以解决与消除它有关的问题。

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