研究

，卷:15(4)DOI: 10.37532/0974-7435.2019.15(4).194

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土产乳发酵益生菌的表型及基因型鉴定

*通信:

Bidyut Bandyopyadhyay维德雅瑟格大学东方科技学院生物技术系，西孟加拉-713102电话:9733306660;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

牛奶发酵制品尤其是凝乳作为益生菌的一种来源乳酸菌具有显著的功能特性，对胃肠道疾病有潜在的治疗作用。本研究的目的是确定基因型以及表型的特征乳酸菌从当地凝乳中分离出来。对革兰氏阳性球菌乳酸菌进行了抑制霍乱弧菌(ATCC 14035)生长的试验。所选菌株还表现出胆盐耐受性和抗氧化活性。因此，在5个菌株中，CS3被证明是最有效的益生菌。因此，CS3的最佳pH值和温度分别为pH 7和40℃。通过扫描电镜证实pb7为链状球菌。CS3分离物的16s rRNA测序提供了一个登录号。NCBI中的MN121704，命名为嗜热链球菌BURD PB8。

关键字

凝乳;胆盐耐受;抗氧化剂;16S rRNA测序;扫描电镜，嗜热链球菌

简介

益生菌只要发酵就会被使用牛奶被使用过，但由于他们健康自上个世纪以来，它的好处是显著的[1］．益生菌对宿主的有益作用必不可少吗营养健康的胃肠功能益生菌定义为“活?微生物适量的:以足够的量施用的;授予健康受益于主持人”[2］．因此，益生菌在医疗实践中发挥了有益的作用，公众和科学界对使用这些活微生物预防或治疗疾病的兴趣日益浓厚[3.，4］．最近的研究表明益生菌广泛地延伸到身体内部，并在某种程度上超出肠道。［5，6在正常健康状况下，占总数的大多数(>90%)细胞它们以细菌的形式存在于结肠中(每克大肠内容物约为1012个)，并形成保护性肠道菌群。

但不同类型细菌的定植是由于饮食习惯和生活方式的改变。乳酸菌属属于人和动物正常有益的粘膜菌群[7]对维持胃肠道很重要健康［8］．乳酸菌通常被认为是无致病性的，能够耐受酸性环境、NaCl浓度和对胆汁的抗性。乳酸菌(LAB)菌株产生杀菌生物活性剂，能够控制病原体的生长。

抗微生物活性益生菌诱导食品的发展，为食品的改良健康消费健康［9］．不同的益生菌对致病菌表现出非常显著的抑菌活性，提出了几种抑制致病菌的建议，也负责产生抗菌化合物，如;细菌素、过氧化氢及有机酸[10-12］．多种作用机制的有益效果益生菌也被建议[13-15]以及益生菌粘附在肠道粘膜上的能力。粘附上皮的能力细胞是益生菌的重要特性。粘附是重要的殖民化益生菌在肠腔内[15］．

小鼠溃疡性结肠炎模型可以使用右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导，与其他化学诱导相比，它具有优势，因为它表现出许多与人类溃疡性结肠炎相似的症状。这种症状溃疡性结肠炎包括腹泻、粪血、体重减轻、黏膜溃疡、大肠缩短和结肠癌。它不仅可以诱发急性期溃疡性结肠炎还有慢性疾病。这模型是有用的和可靠的，因为结肠炎的发展和严重程度在个别小鼠，以及病变。微生物对溃疡性结肠炎使其适合于研究益生菌/益生元在疾病中的作用。发芽大麦(益生菌)和丁酸梭菌(益生菌)对DSS有益模型溃疡性结肠炎在另一个模型(il -10缺失小鼠，醋酸或甲氨蝶呤诱导的结肠炎)乳酸菌水平或添加外源乳酸菌[16］．

材料与方法

进一步的生物进化年龄阶段的生命产生了更复杂和更完善的生命组织，这与温度相关进化在地球上[7］．因此，可以得出结论，温度的影响无疑是种系转化或新生的主要动力[8］．收集样品以分离所需的微生物

进行这项研究是为了分离和鉴定微生物来自印度西孟加拉邦Purba Bardhaman地区的三个不同的本地凝乳样本。不同的凝乳样品是从不同的当地自制的和在当地市场上可以买到的随机收集的。这些样本采集于干净、无菌、宽口容器中。样品采集后立即转移到实验室进行微生物分析，并无菌保存在低温度(-20°C)冰箱，防止污染。

益生菌的分离

在本研究中，使用MRS (deMan, Rogosa和Sharpe)培养基从凝乳样品中分离出细菌。每个采集的样品用灭菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释10克，转移到100 ml MRS肉汤中，用于益生菌的初步分离。将这些溶液添加到MRS肉汤中，孵育6小时后将其划痕到MRS琼脂板上。37℃好氧孵育18-24 h。孵育结束后，选择形成的白色菌落进行单菌落分离。

分离株鉴定

在MRS琼脂板上形成的分离菌落进行了表型(染色和生化试验)和基因型(16s rRNA测序)鉴定。根据Bergey细菌学测定手册进行鉴定。

1.表型鉴定

采用Burkes, 1992和Cruickshank, 1975技术对10株分离株进行革兰氏染色和内孢子染色。对所有分离株进行生化鉴定。以碳水化合物为基础进行鉴定发酵活性试验，过氧化氢酶，氧化酶试验，IMViC试验，精氨酸水解酶试验。［13］．

耐盐试验:通过在600 nm处测定吸光度来测定分离株CS1-CS5的最佳NaCl浓度[17]和无盐MRS肉汤作为对照。分离株在添加了不同浓度NaCl(1-6%)的MRS肉汤中生长，在37°C下厌氧培养24小时。

胆盐耐受性试验:测定分离菌对胆盐的耐受能力[18］．将5株菌株(CS1 ~ CS5)分别接种于含0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%胆盐的MRS汤管中，进行胆盐耐受性试验。在37°C孵育24小时后，通过测量600 nm的吸光度来监测细菌的生长。

对病原体的拮抗作用:使用Mami等人描述的琼脂杯试验评估所选益生菌分离物(CS1-CS5)对所选人类病原体的抗菌活性[19］．琼脂井扩散该方法将无菌无细胞上清液放置在先前接种了试验病原体霍乱弧菌(ATCC 14035)的muller - rehinton -琼脂板上直径7毫米的孔中。在37°C孵育24小时后，测量生长抑制清晰区域的直径。

益生菌分离株的自动聚集:根据凝乳样品(CS1-CS5)的沉淀特征，对所有分离株进行聚集研究。通过在6000×g离心20分钟，4°C收集过夜培养物，并用磷酸盐缓冲盐水(pH 7.3)洗涤三次，然后在相同的缓冲液中消除。然后对混合物进行漩涡处理，在37℃下孵育4 h。计算自聚集率为:

1 - (a)_时间/一个_最初的) × 100

一个_时间和一个_最初的分别在540 nm波长下测量0小时和4小时的吸光度。

抗氧化试验:5个菌株对自由基DPPH的清除作用均按照Lin和Chang的方法测定[20.］．将MRS肉汤中的细菌样品(1 mL)与新鲜制备的1ml DPPH (Sigma-Aldrich)溶液(0.2 mM)混合。摇晃混合物后，在室温下在黑暗中孵育30分钟。对照样品只含有去离子水。然后用分光光度计(Systronics，印度)在517 nm处测定吸光度来监测被清除的DPPH。自由基清除活性以单位/mL (U/mL)量化，计算公式如下[21］．

DPPH活性(U/mL) = (ABS_C——ABS_年代)/ s × 100

在那里,腹肌_C和腹肌_年代分别为对照样品和测试样品在517 nm处的吸光度，S为样品的体积(mL)。

不同pH和温度下最佳生长的测定:为确定分离物CS3的最佳生长温度和pH值，取两组隔夜新鲜培养物，分别接种到pH值为3、5、7、9和11的MRS肉汤(SET i)和pH值为7的MRS肉汤(ii)，分别在0°C、20°C、40°C、60°C和80°C的不同温度下(SET ii)，两组接种肉汤在37°C厌氧条件下孵育24小时。在孵育24小时后，用分光光度计测量细菌的生长，读取560 nm处的光密度，对照未接种的肉汤。

扫描电镜研究:由于在光镜下很难观察到细菌细胞形态的微小变化，本研究采用扫描电镜(SEM)对5个分离株(CS1-CS5)的细胞形态变化或破裂进行了观察[22］．细菌细胞通过6000转/分钟的离心，从每个培养物中回收细胞用磷酸钾缓冲液(50 mM, pH 7.0)洗涤两次。细菌细胞然后在2.5%戊二醛的磷酸钾缓冲液(50 mM, pH 7.0)中固定，4℃过夜。然后用缓冲液清洗两次，用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇系列(v/v)脱水，保存于无水乙醇中。然后将样品干燥至临界点，涂上金，用S-200C扫描电子显微镜检查。

2.基因型鉴定

乳杆菌的分子鉴定:分离株CS1经NCBI初步分析后，经16s rRNA测序鉴定。下载相关序列，用ClustalW软件进行系统发育分析，构建树状图，显示分离株的系统发育关系。序列分析表明，与报道的序列相似度为99%。该16s rRNA分离序列存放在Gen- Bank中，登录号为MN121751。

结果与讨论

用染色法进行表型鉴定

从西孟加拉邦Purba Bardhamaan的Dewandighi当地市场共收集了5份自制凝乳样品。采用一系列传代方法，从每个菌种中分离出5株。MRS琼脂板上白色菌落形态为棒状(Cs、CS4、CS5)和球菌状(CS2、CS3)。为了获得进一步的信息，他们进行了孢子内染色，结果为阴性，如图所示表1并观察到图1．

表1。利用革兰氏染色和孢子内染色等不同染色方法对5个菌株进行表型鉴定。

耐盐试验:从实验中可以观察到，5个菌株在2 ~ 3% NaCl浓度的培养基中均生长良好。分离株的生长被抑制在小于或大于这个范围(2-3%)。因此，从补充表1和中可以看出，菌株NaCl的最佳浓度范围为2 ~ 3%图2．

胆盐耐受性试验:所有菌株对胆盐的耐受性均达到0.5%，但其中CS2和CS3的生长明显高于其他菌株。观察到，随着培养基中胆盐浓度(1%、1.5%、2%、2.5%)的增加，分离株的生长减弱。尽管在每种情况下，指CS2和CS3生长的光密度都高于每种浓度中的其他分离株。(补充表2)。观察结果显示CS2和CS3具有胆盐耐受性(图3)，最高可达1%。

拮抗作用霍乱弧菌：用琼脂杯法观察分离物对一种强效人类病原体的拮抗作用霍乱弧菌，结果令人惊讶的独特，除CS3外，其余菌株均无抑制区(补充表3)。因此，可以得出结论，CS3是唯一可以选择的益生菌菌株，因为它具有抗胃肠道致病病原体的抗微生物特性(图4）.

凝乳样本自动聚合:根据5个分离株的升华特性，对其进行了自聚集试验。在4小时的孵育过程中，所有指示菌株的自动聚集百分比在9%至45%之间(补充表4)。观察结果(图5)表明CS3的自聚集能力最高，但其余4个菌株也有一定比例的自聚集能力。

抗氧化试验:抗氧化活性是强效益生菌的一个重要特性，它是用DPPH的清除活性来衡量的。作为标准参考，抗坏血酸的清除活性被使用，因为它是已知的抗氧化剂的巨大来源。从结果(补充表5)可以看出，所有菌株都表现出最低的抗氧化活性，而与使用的标准菌株相比，CS3表现出最高的清除活性(图6）.

CS3的最佳生长pH值和温度:结果表明，所选菌株CS3具有良好的耐盐、耐胆盐、抗霍乱弧菌、自聚集引发剂和抗氧化剂作用，是一种较好的益生菌。因此，CS3的最适温度和pH值分别为40°C和7，详见(补充表6，图7）.

扫描电镜研究:对于CS3样品的详细观察，在扫描电子显微镜下观察，并观察(图8)为呈链状和簇状的球菌。这一观察也证实了分离物表面的纹理。

基因型鉴定及系统发育分析:CS3的基因型鉴定是通过纯化分离的DNA并扩增16S rRNA测序开始的，该测序由加尔各答KPC医学院进行。我们首先读取收到的部分序列，并通过形成系统发育树(图9)使用BLASTn。这一结果导致一个概念，即该分离物与数据库中存在的任何序列都不是100%同源的。因此，该部分序列被提交给NCBI，并获得了编号。MN121741，命名为嗜热链球菌BURD PB8．

结论

以上实验结果表明，所有分离株均为革兰氏阳性杆状菌和Garam阳性球菌，且均为无胞内形成菌。5个菌株均表现出较好的耐盐和胆盐性，但以CS3的生长能力最强。此外，CS3在拮抗作用中有显著的效果霍乱弧菌，自聚集效应，抗氧化活性。CS3的最适pH值为7℃，最适温度为40℃。因此CS3支持分离株在人体胃肠道中的生长。这表明CS3是一种有效的益生菌，经16S rRNA测序确定为一株新的益生菌乳酸链球菌BURD PB 8和注册编号。MN121741。

鸣谢

作者非常感谢西孟加拉邦Burdwan的东方科学技术研究所为目前的研究工作提供了实验室设施和必要的支持

利益冲突

Atrayee Roy, Madhumita Mitra和Bidyut Bandyopadhyay确认本文内容没有利益冲突。

贡献

Bidyut Bandyopadhyay和Madhumita Mitra帮助设计实验，分析数据;并研制方法、材料制备。实验由Atrayee Roy完成，并由前面提到的其他两位作者监督。Atrayee Roy与Bidyut Bandyopadhyay和Madhumita Mitra共同撰写了手稿。所有作者在投稿前都批准了稿件。

参考文献

1. Patel AK, Ahire JJ, Pawar SP，等。益生菌特性的比较分析芽孢杆菌spp．与食物垃圾隔离。食品科学，2009;42(4):505-10。
2. 粮农组织/卫生组织对健康以及粉末的营养特性牛奶和活乳酸菌。正确的做法:食品农业联合国和世界组织健康组织专家咨询报告，罗马，2001年。
3. Miele E, Pascarella F, Giannetti E，等。益生菌制剂(VSL#3)对儿童溃疡性结肠炎诱导和维持缓解的影响。中华胃肠病杂志。2009;39(2):344 - 344。
4. Niedzielin K, Kordecki H, Birkenfeld B.一项对照双盲随机研究乳杆菌肠易激综合征患者服用299V。中华胃肠病杂志2001;13(10):1143-47。
5. 郭志刚，王晓明，王志刚，等。细菌感染导致压力诱发内存小鼠功能障碍。肠道。2011;60(3):307 - 17所示。
6. Bravo JA, Forsythe P, Chew MV，等。摄入乳酸菌菌株通过迷走神经调节小鼠的情绪行为和中枢GABA受体表达。美国国家科学研究院。2011; 108(38): 16050 - 55。
7. 张志刚，张志刚，张志刚，等。益生菌特性乳酸菌源自猪肠和粪便的分离株。厌氧菌。2010;16(3):293 - 300。
8. 顾仁祥，杨志强，李志华，等。益生菌特性乳酸菌从新疆和田地区和广西巴马地区长寿人群的粪便样本中分离出来。厌氧菌。2008;14(6):313 - 37。
9. Eduardo L, Chuayana JR, Carmina VP，等。抗菌活性益生菌从牛奶菲尔的产品。中华微生物学杂志，2003;32(2):71-4。
10. Charlier C, Even S, Gautier M，等。酸化作用不参与早期抑制金黄色葡萄球菌增长Lactococcus lactis牛奶中。国际乳业杂志，2008;18(2):197-203。
11. 林文华，黄丽伟，陈海燕，等。基于可变计数的商业特征评价乳酸菌产品。食品微生物学。2006;23(1):74-8。
12. 黄志强，黄志强乳酸菌从特内里费奶酪分离出来:植物素TF711的初步表征，一种细菌素样物质由乳杆菌TF711。应用微生物学杂志，2005;99(1):77-84。
13. 吴志强，李志强，李志强，等。益生菌的作用机制:最新进展。中华肠炎杂志2009;15(2):300-10。
14. 谢尔曼PM, Ossa JC, Johnson-Henry K.揭示益生菌的作用机制。2009年临床实践;4 24(1):打败。
15. 李比尔，范德利登，德克尔斯麦克尔。支持益生菌作用的乳酸菌基因和分子。微生物学通报，2008;32(4):728-64。
16. 冈洲I，畑山S，山田M，等。一种新颖的实验急性和慢性诱导方法溃疡性结肠炎在老鼠身上。胃肠病学。1990;98(3):694 - 702。
17. Quwehand AC, Vesterlund S.乳酸菌抗菌成分。乳酸菌、微生物学和功能方面。2004:375 - 96。
18. Graciela FVD, Maria PT.食品微生物学益生菌的特性乳酸杆菌．Totowa: Spencer Humana Press Inc, 2001。
19. 马米阿兹，布梅希拉阿，哈梅迪JE，等。本地筛选乳酸菌物种源自阿尔及利亚的生山羊牛奶用于生产细菌素类化合物金黄色葡萄球菌．中国微生物学杂志，2012;11(20):88-98。
20. 林敏，常芳。肠道细菌的抗氧化作用双歧杆菌longumATCC 15708和嗜酸乳杆菌美国国家医学图书馆，2000;45(8):1617-22。
21. 郭志刚，田中勇，等。原生动物对牛瘤胃液和血浆抗氧化活性的影响。化学学报。2007;78(1):34-40。
22. 李文杰，李志强，李志强，等。在体外两种益生菌活菌和热杀菌的聚集和粘附特性的研究乳酸菌特别是与食源性人畜共患细菌的菌株和相互作用空肠弯曲杆菌．中华医学微生物学杂志，2013;62(4):637e49。