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聚合物清除和概要文件的大肠杆菌0111:B4 MALDI-TOF脂多糖

*通信:

玛丽亚·费尔南达梅洛科斯塔CHASP怀卡托理工学院,3240年,汉密尔顿,新西兰怀卡托
电话:+ 64-07-834-8800;电子邮件:equipecentaurovet@hotmail.com

文摘

脂多糖是一个组成部分细胞膜革兰氏阴性细菌,是一种炎性物质;少量存在于哺乳动物的血液可能是致命的。脂多糖的清除血浆已经尝试以前但使用分子印迹聚合物为此还没有描述。这项初步研究利用单个脂多糖类型调查由分子清除聚合物,用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)来检测这种清除。从大肠杆菌O111商用有限合伙人:B4受到MALDI-TOF分析检测解决方案包含纯有限合伙人或有限合伙人概要文件被暴露于印,non-imprinted的解决方案聚合物与清除的潜力。目前的研究表明潜在的分子印迹聚合物作为有限合伙人的食腐动物,尽管印记协议需要优化。MALDI-TOF是一种适当的方法来检测有限合伙人的概要文件和有限合伙人消除从样本。

关键字

大肠杆菌;脂多糖;技巧;分子印迹聚合物;扫气

介绍

内毒素,也被称为脂多糖或有限合伙人,是一个重要的组成部分细胞膜革兰氏阴性细菌。有限合伙人是发布的细菌细胞死亡或扩散1]。革兰氏阴性细菌通常存在于哺乳动物的胃肠道和有限合伙人可以释放到血液中如果肠道通透性改变。

一旦有限合伙人收益进入血液,它激活免疫和炎症反应2]。剂量的内毒素1μg /公斤体重足以诱发冲击成人(3]。其他哺乳动物也很容易接触到有限合伙人和endotoxaemia导致死亡。

慢性接触有限合伙人在内的发展代谢综合征和胰岛素抵抗导致人类的糖尿病4)的发展代谢综合征和慢性蹄叶炎在马5]。

次要的,但非常重要的问题关于木糖醇是频繁的药物制剂的污染。此类产品污染的担忧,因为无意的消费的影响有限合伙人的病人使用这种产品。等生物制品的污染来自质粒(DNA重组)革兰氏阴性细菌会干扰研究实验,可以如果利用有毒在活的有机体内(6]。

有限合伙人由三部分组成:多糖啊,一个核心的低聚糖和脂质a多糖允许特定的抗体形成针对特定菌株的有限合伙人,但它是脂质部分导致激活的炎症级联7,8]。

几个都试图找到治疗药物进行了调查,清除内毒素的循环,或减轻LPS的炎症影响虽然物质测试过几个候选人,包括一些可接受的成功,没有合成清道夫专门从流通中提取内毒素。

MALDI-TOF被描述为一个可行的方法,分析复杂的脂质(9)和有限合伙人物种除了大肠杆菌研究了使用这种方法(10]。H抗原(11)和脂质大肠杆菌已确定使用MALDI-TOF [12]。

LPS检测提出了一个复杂的问题;尤其是有限合伙人中有能力坚持最表面由于易于存储和分析和污染。

量化的高效液相色谱法已被证明不一致,并使用比色分光光度法测定可能造成退化的有限合伙人的挑战分析,以及分析物的损失由于表面粘附或分析由于污染浓度的增加。虽然不是一个有效的定量方法,MALDI-TOF提供现货干燥样品的优势,将有限合伙人坚持表面的缺点转化为一个理想的协议的一部分。

不同基质的影响进行了调查研究与MALDI-TOF有限合伙人的检测13,14),但没有发现出版物的时候写这手稿关于使用MALDI-TOF作为有限合伙人的检测方法与潜在反应后清除分子。

分子印迹聚合物(MIPs)模拟抗体的能力,把物质从各种解决方案和稳定在一个范围的媒体;迄今为止,然而现有的合成方法对于MIPs很难印大型有机分子。本研究的目标之一是调查两个的能力聚合物从有限合伙人在体外,用乙二醇利用(EDMA)和胆红素的制造过程。另本研究的目的是探讨使用Matrix-Assisted激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)作为有限合伙人可重复的和可靠的检测方法及其清除从解决方案添加化学物质。

材料和方法

样品

最初确定的化学剖面有限合伙人需要标准化之间的反应聚合物有限合伙人可以监视和测量。

商用有限合伙人的大肠杆菌O111: B4 (Sigma-Aldrich、产品L2630)购买和重组对检测方法的验证和测试这两种聚合物的清除能力。

有限合伙人概要

的协议对这个实验描述如下(MALDI-TOF)。有限合伙人样品在去离子水稀释浓度为1% (10000 ppm)的这一部分的研究。一旦一个一致的有限合伙人概要文件获得,有限合伙人样本准备和分析如下所述。

试验1

参与反应的产物之间的第一代MIP (MIP1);non-imprinted聚合物(NIP1)和有限合伙人在5种不同浓度。概要文件获得有限合伙人+ MIP1和有限合伙人+ NIP1比较纯有限合伙人概要文件(控制)。

有限合伙人的稀释后利用:1000 ppm;500 ppm;100 ppm(稀释100%甲醇);75 ppm和50 ppm(稀释的甲醇和水;3:1)。下面添加800μl每个有限合伙人的稀释:100μl印迹聚合物悬浮液(S5 S1)或100μl non-imprinted聚合物悬浮液(S10 S6)或100μl去离子水(S7 S15)。样本储存在4°C到分析。

试验2

参与测试时间整除的反应之间的第二代MIP (MIP2);non-imprinted聚合物(NIP1)和有限合伙人在2不同浓度。

试验执行时使用100 ppm和75 ppm LPS稀释,用上述溶剂。样本的标签按字母顺序:A、B和C包含有限合伙人100 ppm,而D, E, F包含有限合伙人75 ppm。

三、4500年μl整除每个两个有限合伙人的稀释被安置在格里芬烧杯和六个磁搅拌盘与搅拌珠不断的搅拌。500的第二代MIPμl加入整除A和C;500μl non-imprinted聚合物的加入能整除B和D;和去离子水添加500μl整除E和f .最后为每个样本5000μl反应体积。

200μl整除被从反应烧杯乘以0,1分钟,2分钟,3分钟,4分钟,5分钟、10分钟、30分钟和60分钟,放在埃普多夫管。时间能整除snap-frozen并存储在4°C到分析。

MALDI-TOF分析

所有样本分析一式三份和运营商和科学家进行结果的分析样品中什么也不清楚。

实验有限合伙人每个试验样本被发现在100孔MALDI-TOF板后立即被vortex-mixed 1分钟。1μl样本被发现在每个好,允许空气干燥。一旦样品干燥,1μl矩阵(6-aza-2-thiothymine-ATT-dissolved 10毫克/毫升在乙腈/水1:1 v / v) (13- - - - - -15)被发现直接在干样和还允许空气干燥。控制和空白样品也出现在相同的方式。

一旦样品被干燥,板插入到Voyager-DE MALDI-TOF质谱仪(应用生物系统公司Voyager-DE Pro)。样本然后受到100年激光枪。谱技术设置:激光强度:2674;负离子模式和线性;20000 V。质量范围设置为1000 Da - 4000 Da,使最好的有限合伙人概要文件。样品显示良好的分辨率和质量配置文件匹配当前文学有限合伙人MALDI-TOF概要文件。

分子印迹聚合物(MIPs)

有限合伙人之间的复杂和功能单体生成和胆红素复制复杂的聚合物的格式是使用传统cross-linkers(乙二醇利用[EDMA])。EDMA矩阵产生一个单片粉后初始合成和处理已经完成。形成创建一个锁和钥匙模型特性的聚合物形成的目标物种(有限合伙人)作为模板。一旦形成目标物种是删除。这就产生了一系列的结合位点的特征和“形”结合选择性有限合伙人和忽视其他化合物/分子。

MIP食谱的制定执行使用保密方法,减少配方和聚合物发展值得注意的是,与配方开发在24小时内进行两次。开发过程导致了基本配方,测定中描述表1。

表1。基地有限合伙人MIP的秘方。

有限合伙人被视为配方允许扩展的限制因素(增加或减少)基于其他试剂之间的比例关系和有限合伙人的重量。

使用对基础配方的比例关系,聚合物生成所需的测试:试剂混合,结合和反应在两天时间内,然后用于处理实验过程。

结果与讨论

MALDI-TOF光谱与上述方法有限合伙人产生了一个明确的和一致的有限合伙人概要文件(图1)。集群的大规模山峰之间观察到的1200年和3400年m / z, 4不同的山峰定期约1200 m / z 1500 m / z 1900 m / z和2300 m / z。

试验1

当1000 ppm和500 ppm样本分析,光谱与LPS剖面观察明显的相似之处,不管使用的溶剂和MIP、夹和空白。

有限合伙人峰值退化的质量约1936都被观察到夹和MIP,但不是在100 ppm的空白稀释(图2一个,图2 b和图3一,图3 b)。

有限合伙人峰观察损失在75 ppm有限合伙人夹。损失被认为在下列质量:1925年达到顶峰,2226和2556.75 ppm有限合伙人与MIP维护这些山峰,空白(也图4一,图4 b和图5一个和图5 b)。

试验2

期间试验,观察峰损失从3分钟有限合伙人之间的反应和夹有限合伙人(100 ppm和75 ppm解决方案),直到60分钟(时间试验结束)。山峰的损失在75 ppm有限合伙人准备更加明显。

峰退化观察但不损失有限合伙人+ MIP从3分钟的时间试验仅有限合伙人在75 ppm解决方案。峰退化和损失在100 ppm。空白解决方案显示完整的有限合伙人概要文件在整个时间试验。

为了探讨LPS的清除能力一个印,一个non-imprinted聚合物,采用几种方法,包括高效液相色谱法、分光光度法和MALDI-TOF。只有MALDI-TOF协议提供一致的和可重复的结果和上面的数据表明MALDI-TOF是一个可靠的和一致的方法来检测和分析有限合伙人,成为一个有价值的方法,调查潜在的有限合伙人的清除聚合物和其他化学物质。

研究结构的组成大肠杆菌K12的表明,有限合伙人是异构的,但有一个主要和两个与群众之间的轻微改变2980 m / z和3092 m / z (16]。在当前研究纯化有限合伙人大肠杆菌血清型0111:B4与大众使用,结果表明山峰1200 m / z - 3000 m / z。最丰富的峰值检测大约1270 m / z 1290 m / z,暗示monophosphorylated物种。

的协议用于本研究利用6-aza-2-thiothymine (ATT)作为矩阵,因为这产生了清晰的光谱,虽然其他矩阵进行测试(结果未显示)。这是根据以前的出版物分析大肠杆菌血清型0116证明MALDI-TOF光谱有限合伙人是高度依赖于矩阵利用[13]。

在目前的研究中,两个聚合物被当作潜在的有限合伙人和食腐动物测试的能力谱来检测这种清除。延展性和性质的聚合物配方快速发展使得它成为一个考虑未来实验没有严重影响的时间尺度上,它应该是必需的。

最初的配方开发了使用高效液相色谱级纯甲醇(西格玛奥德里奇)由于胆红素单体溶解能力。有限合伙人复杂但是经验不愿在纯甲醇中溶解,需要广泛的机械作用。初始测试开发配方使用甲醇得以执行,但有限合伙人的溶解度需要考虑。在聚合物的形成胆红素和目标物种必须能够在选择溶剂溶解。溶解所需的广泛行动的有限合伙人纯甲醇中不合适的和笨拙。

为了规避这个问题,两个使用适当的溶剂的混合物。有限合伙人将很容易溶解在去离子水。胆红素是不溶于水,但稀释的甲醇溶液的甲醇仍将提供充足的水分含量是有限合伙人能充分溶解。合适的甲醇/水比例是由溶解有限合伙人1毫升的水,胆红素是补充说,1毫升整除的甲醇直到胆红素和有限合伙人都介绍了水溶性和仍在解决方案。这个决定一个3:1甲醇:水解决方案是足够的溶剂。

创建一个初始反应半固态聚合物泥浆,这是传播到一个粒子筛分级促进干燥和准备。评分是一个两步的过程,首先减少聚合物“团”和粒子的大小。地面粒子与多余的溶剂,然后制成浆足够大小的粒子将解决的解决方案与小颗粒被删除上层清液(这是重复,以确保有效的去除)。剩下的泥浆耕种和干。MIP被存入一个索氏仪器20 h去除粘溶剂和大量未反应的试剂任何踪迹。然后放置在干粉悬挂1毫升的3:1甲醇:水每100毫克的聚合物。悬架是旋转和混合一夜之间,允许聚合物膨胀毛孔t o开放使他们更容易获取有限合伙人复杂。这种悬架然后用于描述的实验报告。悬挂的过程从最初的反应是“准备使用”可以在一到两周进行。

聚合物的混合物悬浮和测试解决方案主要应用在这个项目。与其他可能的媒介可以进一步的研究和发展,这些可能包括附加的聚合物滤筒/膜或列包含聚合物/ s的制造;虽然列不推荐生产直到实验进一步进展。

在这个项目中执行的实验使聚合物“消耗品”,这意味着它被视为一个“一次性”组件。在未来的实验,保留和再生的聚合物可以用于试剂费用最小化。这仍然会消耗时间,但实际应该降低整体时间通过限制聚合物生成周期。是否这是一个适当的行动方针的最终应用聚合物仍有待确定。

成功的印记一个EDMA矩阵后,聚合物基于吡咯将试图将完全不会引起排斥的。基于吡咯聚合物也有一个小得多的影响聚合物生产的时间尺度和随后的实验。配方可以确定聚合物的反应和处理在48 h,大大减少等待时间之间的生成和实验。可以用它以同样的方式测试期间使用这个项目。它也有一个范围的交付选项,可以提供更多和更多样化的测试方法。吡咯聚合物的形成确实需要一个更大的质量目标物种然而最低生产。需要最少数量的50毫克每批聚合物,但是实验之间的聚合物也可以检索和再生周期。生成的聚合物也将达到一个更高的质量和体积比胆红素聚合物。即使作为一个“一次性”产品,生成总量明显可以分布在一个更大数量的测试。

在下面的讨论中,“峰退化”是指存在峰值或递减的质谱峰,表明这个部分的有限合伙人在反应的影响。“损失峰值”指的是清晰的没有重复的质谱峰,表明这部分有限合伙人不再出现在反应中,由于回收的聚合物。

有限合伙人扫了浓度1000 ppm时和500 ppm,卷100μl聚合物(压印和non-imprinted)无法改变有限合伙人概要文件的空白。这可能是由于聚合物不足或完全消耗任何探测峰值恶化之前是可观测的。

MALDI-TOF被证明是可靠的和可重复的方法检测有限合伙人也记录有限合伙人之间的反应的影响以及不同的聚合物。这种方法可以用于未来的试验研究不同的结构/化学品的绑定和清除能力有限合伙人从一个解决方案。

压印和non-imprinted聚合物显示恶化的能力有限合伙人有限合伙人100 ppm解决方案的概要文件,表明发生反应。尽管恶化,这个反应是不足以消除任何山峰在有限合伙人的概要文件,这表明不适当的绑定。

的两个聚合物使用,只有non-imprinted显示能力降低有限合伙人,山峰被淘汰,在概要文件被改变。峰损失未见的印迹聚合物,或空白。这个结果表明,非特异性,non-imprinted聚合物的结合部分演示能力有限合伙人和改变自己的形象,建议删除部分有限合伙人分子的能力。

这一发现可用于压印的生产过程聚合物改善的方向印迹聚合物的化学结构。这一发现也提供了证据表明,有限合伙人的基本面清除聚合物是可能的,尽管进一步的研究需要绑定的印记和特异性。

结论

这初步在体外研究评估的能力MALDI-TOF分析检测的有限合伙人概要文件大肠杆菌O111: B4和测量的能力聚合物有限合伙人。结果显示使用这种潜力MIP为实时LPS清除消除有限合伙人的制药配方。改善MIP设计应该导致一个第三代构造与增强的清除能力,虽然需要进一步的研究来调查MIP清除能力有限合伙人的等离子体在体外。

确认

资金:本研究由怀卡托理工学院(威特)研究办公室通过一个可竞争资金拨款发给梅洛科斯塔(威特)博士和博士Miruna Petcu (Ligar)。

的利益冲突

作者没有其他实际或潜在的利益冲突。

没有动物或人类被试被用于这项研究。

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