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苯扎溴铵与葫芦[7]脲的超分子相互作用及其分析应用

*通信:

跟包D山西师范大学化学与材料科学学院，山西临汾，中国电话:029 - 85308442;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

苯扎溴铵(BKB)在水溶液中荧光较弱，难以直接用荧光法测定其浓度。本研究采用荧光光谱法研究了BKB与巴马汀争夺葫芦[7]尿素(CB[7])腔的竞争反应。Palmatine与CB[7]反应形成具有强荧光的探针。然而，BKB的存在猝灭了探针的荧光。荧光猝灭速率与BKB浓度成正比。与CB[7]形成超分子复合物提供了一种简单、准确和高灵敏度的荧光探针，用于商业注射溶液和血浆样品中BKB的测定。方法线性范围为0.004 ~ 1.768 μg mL-1，检出限为0.002 μg mL-1。建立了BKB与CB[7]相互作用的分子模型，并通过1H NMR进行了验证。讨论了探针的荧光机理。该方法在治疗监测、药代动力学和临床应用方面具有潜力。

关键字

苯扎溴铵;荧光探针;葫芦[7]uril;非洲防己碱

简介

苯扎溴铵(BKB;（方案1))，又称烷基二甲基苄基溴化铵，是一种含氮阳离子表面活性剂，属于季铵族。它主要有三种用途:作为生物杀菌剂、阳离子表面活性剂和化学工业中的相转移剂。BKB一般用作消毒剂的有效成分[1，2]、消毒剂[3.-6]和防腐剂[7-11]，可用作食物防腐剂，但这项用途是不被允许的[12，13］．虽然BKB是一种有效的抗菌和抗真菌剂，但已证实对表面上皮细胞有副作用，从体外和体内研究确定，这与它的长期使用有关慢性疾病在特定的。生物和药物样品中BKB的测定方法有很多，包括质量光谱法［14]，高效液相色谱串联质谱光谱法［15]、离子选择电极膜[16]，高性能液体色谱法［17，18),电位传感器［19]、超高性能液体色谱法［20.]，毛细管带电泳［21]和毛细管电泳［22，23］．而报道的液相色谱、质谱和离子选择电极膜分析一般需要复杂的提取工艺，耗时的操作步骤，复杂而昂贵的设备和劳动密集型的样品制备程序。虽然易于操作，毛细管电泳方法是有限的，因为低药物样品的敏感性。因此，迫切需要一种灵敏、简单的检测方法来检测BKB。

在超分子化学领域，葫芦苷及其独特的结构和性质自2000年首次报道其制备和连续分离以来备受关注[24］．葫芦[7] uril (CB [7];方案1)是一个大环，包含7个甘脲单元，由14个亚甲基连接。它具有疏水内腔和两侧围绕羰基氧原子的开口。两个开口尺寸相同，直径小于腔体直径。腔体两端的羰基可以通过离子偶极子或氢键相互作用结合阳离子和客体分子。CB[7]还能选择性地与各种有机阳离子和金属离子形成包合物[25，26］．CB[7]作为一种分子容器或宿主，可以包封小分子进行部分或完全保护。早期研究表明CB[7]可与一种或两种脂肪族胺或芳香族胺形成各种超分子配合物[27，28]并与过渡金属盐或非过渡金属盐形成配位化合物以增加其水溶性。CB[7]在分子识别领域有许多潜在的应用[29-31］．本文采用Palmatine (PAL;方案1)作为探针。发现PAL与CB[形成1:1络合物]。7]，导致PAL的荧光强度增强，当体系中加入适量BKB时，荧光强度有规律地下降。基于荧光强度(ΔF)变化与BKB浓度的线性关系，建立了一种简单、高选择性的测定BKB的荧光法。研究了PAL-CB[7]配合物可能的相互作用机理¹H核磁共振以及计算方法。本文还讨论了BKB的加入机制。

实验

仪表

荧光测量是在Cary Eclipse上进行的荧光谱仪(美国)。所有测量均在25.0°C±0.5°C下使用标准10mm径长石英电池进行。在U-3010紫外可见分光光度计(日立，日本)上测量吸收光谱。¹H核磁共振光谱使用Bruker AV 600 MHz光谱仪(瑞士)在D₂O用DCl (0.10 mol L^－1)．利用高斯09程序在密度泛函理论的B3LYP/6-31 G (d)水平上优化分子建模计算。

材料和试剂

巴马汀(PAL)从中国药品生物制品检验研究院(北京)获得。苯扎溴铵(BKB)购自多伦多研究化学品公司。测定滴眼液制剂妥布霉素滴眼液(0.01%，s.a Alcon-Couvreurn.v)的BKB含量。所测试的制剂中含有BKB作为防腐剂。CB[7]根据报道的方法制备和表征[32，33］．CB [7]股票1.0 mmol L溶液^－1将CB[7]用双重蒸馏水溶解于100ml容量瓶中制备。所有的股票标准溶液在室温下可稳定数周。用0.01 mol L制备布列顿-罗宾逊缓冲液^－1硼酸、乙酸和磷酸，pH值用0.05 mol L调整^－1氢氧化钠或盐酸。所有其他化学品均为分析级，在整个过程中均使用双蒸馏水。

光谱测量程序

在不存在或存在BKB或样品的情况下，使用激发波长为344 nm进行PAL和配合物的荧光测量。在10ml比色瓶中，0.8 mL为0.1 mmol L^－1CB[7]溶液，0.8 mL 0.1 mmol L^－1探针分子溶液(PAL)，然后加入0.1 mL 0.001 mol L^－1依次加入布列顿-罗宾逊缓冲溶液和一定浓度的BKB标准溶液或样品溶液。用双蒸馏水将混合物稀释至体积，在室温下摇10分钟。

药物制剂中BKB的制备

采用荧光法测定了各种药物制剂中的BKB同源物。市售妥布霉素滴眼液采用固相萃取法，使用含有强酸阳离子交换树脂的墨盒(1cm × ø 1cm, 001 × 7(732))。用2 × 1ml甲醇和2 × 1ml水对墨盒进行条件处理，然后装入1.0 mL妥布霉素滴眼液。依次用1ml水、1ml甲醇和1ml水漂洗后，用1.0 mL 0.05 mol L进行洗脱^－1盐酸。然后，按照一般程序进行。

人血浆中BKB的制备

该方法可用于监测健康志愿者口服BKB药物后血浆中BKB浓度的时间依赖性。志愿者预先服用80mg BKB，并在24小时内的不同时间收集血浆。血浆样本1.0 mL置于离心管中，10000 rpm离心12 min，取清上清，装入相同的固相萃取盒，同样条件下，冲洗，洗脱(药物制剂中BKB分析)。然后，按照一般程序进行。

结果与讨论

实验条件优化

温度和反应时间的影响:在10°C至70°C范围内考察了温度对ΔF的影响。形成的配合物是稳定的，ΔF在40℃以下没有明显的突变(图。1)．然而，在40°C以上，荧光强度大大降低，因为配合物在高温下解离。因此，所有后续测量都在室温下进行。

此外，在加入CB[7]和PAL后，ΔF在10分钟内达到最大值，并在数小时内保持不变(图。2)．因此，测量是在室温下混合试剂10分钟后确定的。

pH的影响:研究了pH在1.0 ~ 12.0 (图。3)．结果表明，在pH 1.0 ~ 4.0范围内，ΔF最大，变化不大;然而，随着pH大于9.0，ΔF显著降低，因为碱阳离子在碱性介质中容易与CB[7]的羰基流线型门户相配位。碱阳离子的结合降低了有机客体进入的速率常数[34］．结果表明，在碱性介质中钠盐的存在不仅降低了PAL与CB[7]结合的平衡常数，而且降低了荧光量子产率。因此，通过使用盐酸，将pH调整为4.0，这是后续实验所需的pH值。

PAL在水溶液中与CB[7]结合

CB[7]在水溶液中是一种非荧光物质，PAL只能发出微弱的荧光。值得注意的是，在PAL溶液中加入CB[7]后，荧光强度明显增强(图。4)．荧光强度增加的因素是CB[7]改变了PAL的共轭面刚性结构，形成了CB[7]-PAL的复合物质。PAL和CB的浓度从1.0 μmol L起为[7]^－1至13 μmol L^－1在495 nm处进行荧光强度测试，结果表明CB[7]-PAL复合物在8 μmol L^－18 μmol L中加入CB[7]^－1水溶液中的PAL。

BKB对CB[7]-PAL络合物形成的影响

在酸性水溶液中，PAL和BKB荧光发射微弱，CB[7]不荧光。而在CB[7]存在的情况下，PAL的荧光强度大大增加。有趣的是，当BKB加入到PALCB[7]复合物中时，荧光明显淬灭(图。5)．BKB量与ΔF有明显的相关性。随着BKB浓度的增加，荧光猝灭更加明显。BKB对PAL-CB[7]配合物的影响采用紫外分光光度计(图6。)．BKB存在时，PAL-CB[7]配合物的光谱蓝移至344 nm。与CB[7]结合的PAL荧光较强，可以解释为PAL包裹在CB[7]腔内，表明PAL具有共面结构。BKB的加入导致荧光猝灭，因为BKB与PAL之间存在竞争反应，BKB与CB[7]之间的相互作用强于PAL与CB[7]之间的相互作用，从而导致PAL从CB[7]腔中去除。用紫外分光光度法进行了验证。

主客体络合反应的响应机制

PAL分子含有一个异喹啉环和一个取代苯环。从表面上看，PAL具有较强的荧光发射，因为其共轭体系较大。但PAL中异喹啉与取代苯环之间是一个六原子环的桥接，因此两个环不在同一平面上。因此PAL分子不能形成共轭体系，导致荧光较弱。当PAL与CB[7]混合时，PAL的极性异喹啉环部分固定在CB[7]空腔中，引起PAL杂环氮的正电荷与大环羰基氧的高电子密度之间的静电吸引。结果，异喹啉与取代苯环之间的二面角变小。这种变化导致结构更接近于共轭平面刚性结构能源最小化。PAL分子的运动自由度被削弱，从而也降低了无辐射跃迁的概率。CB[7]引起的PAL结构变化是荧光增强的主要因素。当BKB加入PAL-CB[7]系统时，BKB会与PAL竞争占据CB[7]腔。由于BKB的引入，部分PAL分子将被迫离开CB[7]腔。图。7)．在CB[7]的疏水腔外，PAL受到局部微环境的影响，导致PAL荧光猝灭。

理论计算

分子建模密度泛函理论计算在B3LYP/6-31G (d)水平上进行优化[35-37]使用高斯09程序(高斯公司，沃灵福德，康涅狄格州)。分子模拟结果证实了PAL分子的异喹啉环的α-氧位于CB[7]的空腔中。在PAL、CB[7]和BKB的混合物中，BKB对CB[7]的结合能力比PAL强得多，其氮在CB[7]的入口处与羰基相互作用。因此，PAL分子被挤出CB[7]腔(图8。)．然后BKB的苄基进入CB[7]腔，使荧光猝灭。

¹H核磁共振

的¹H核磁共振CB[7]-PAL的光谱得到了证实[38］．图9。展示1H核磁共振CB[7]、BKB和CB[7]-BKB配合物的光谱。调查结果¹H核磁共振实验结果与复合物的理论结构一致。化合物的化学位移依赖于高度敏感的微环境。结合BKB的H15, H16, H16'， H17, H17'和H18质子的信号相对于自由BKB的信号转移到更高的场。这些结果表明BKB分子的取代苄基部分被包裹在CB[7]腔内。上述讨论与此一致。

干扰物质的作用

在实际样品通过提出的荧光探针法测定之前，对干扰物质(片剂常用辅料)的测定量为0.2 μg mL^－1在最佳实验条件下对BKB进行了评价。第一次测试的质量超过BKB的每个干涉物质的3000倍。当干扰发生时，该比值逐渐减小，直到干扰停止。干涉判据为干涉物质前后荧光强度的变值均大于±5%。结果表明，常用辅料对测定基本无干扰。在实际样品的试验中，辅料中未发现其他与BKB结构相似的干扰物质，说明在药物配方中检测BKB具有良好的选择性。然而，人类血浆样本中的成分(K⁺, Na⁺、钙^{2 +}、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸等)可在一定程度上淬灭CB[7]-PAL的荧光强度。因此，在检测前应将其从血浆样本中去除。此外，本工作采用二氯甲烷萃取法将其从血浆样品中去除。

校准图及灵敏度

在最佳实验条件下，通过绘制ΔF与BKB浓度的关系来绘制标准校准曲线，其中ΔF表示CB[7]-PAL与CB[7]-PAL-BKB荧光强度的差值。在8.0 μg moL-1 CB[7]-PAL配合物溶液中，荧光强度随浓度呈线性变化的关系0.004 μg mL之间^－1至1.768 μg mL^－1．线性回归方程为ΔF=371.32C+39.21 (C为以μg mL为单位的浓度)^－1)．BKB的相关系数为0.9979，检测限为0.002 μg mL^－1在3σ时，同样的阶数，表明良好的线性和灵敏度。该方法测定BKB的灵敏度高于其他已报道的方法，结果令人满意。

分析应用程序

药物制剂分析:本文介绍了药物制剂的分析结果表1．该方法的相对标准偏差小于2.0%。此外，t检验显示了对准确性和精密度的满意。为确认所提方法的有效性，将BKB添加到药物采用标准添加法，加样回收率为97.25%±0.89% ~ 104.00%±0.45%。

表1:BKB含量测定制药配方(n = 5, t_0.054 = 2.78)。

人血浆BKB含量分析

荧光探针还应用于人血浆样品中BKB的测定。通过考察三种浓度水平下BKB的回收率，评价了方法的准确性。从0 h到4 h，血浆中BKB浓度随着代谢时间的增加而增加，在4 h到4.5 h时达到最大值，随后血浆中BKB浓度下降。每种浓度重复测量5次。回收率百分比表2介于97.07%±1.53% ~ 100.56%±0.46%之间。相对标准偏差均小于2.00%。结果表明，该方法具有较高的成本效益、灵敏度和选择性药物动力学BKB。

表2:荧光法测定人血浆中BKB (n=5)。

结论

CB[7]与BKB和PAL的超分子相互作用为BKB的测定提供了一种简便、快速、准确、灵敏的荧光方法。PAL是研究BKB与CB[7]在水溶液中的主-客体络合反应的一种很好的荧光探针，因为当PAL从CB[7]腔排出到水相时，PAL的荧光强度发生了显著的变化。通过吸收、荧光光谱法、¹氢核磁共振，分子建模理论计算。这些技术的综合结果使我们得出结论，CB[7]在水溶液中与BKB形成了稳定的1:1包合物。该方法灵敏度高，选择性好，可用于药物制剂和血浆中BKB的分析。常用辅料不干扰BKB的测定。这种基于CB[7]的荧光方法将有助于在药物研究中监测BKB的代谢。我们实验室正在进行相关研究。

确认

国家自然科学基金(No. 81402895)资助。我们也非常感谢匿名推荐人提供的有用建议。

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