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头孢噻肟钠与转铁蛋白相互作用的同步荧光特性

*通信:

刘B(河北大学化学与环境科学学院河北省分析科学与技术重点实验室，河北保定071002)电话:0312 - 5079650;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

采用同步光谱法分析了头孢噻肟钠与转铁蛋白在不同温度下相互作用的光谱特征。与此同时,紫外吸收光谱学用于补充和验证同步光谱学的结论。结果表明，头孢噻肟钠采用静态猝灭法猝灭转铁蛋白的荧光。利用静电力产生了新的化合物。新化合物不刺激或抑制后续配体与转铁蛋白之间的相互作用。转铁蛋白中的色氨酸和酪氨酸均参与相互作用。圆二色性光谱学表明转铁蛋白的肽链变松，蛋白质的α-螺旋二级结构发生改变。

关键字

同步荧光光谱;淬火反应;协同作用;静电力

简介

转铁蛋白由同源叶状体组成，每个叶状体分为两个结构域，负责金属离子和矿物质的转运[1］．转铁蛋白半衰期短，贮存量小。如果摄入不足，其数量会迅速下降能源和蛋白质，将迅速恢复正常后，充分的摄入量能源和蛋白质。因此，转铁蛋白可作为评价新生儿营养状况的良好指标。转铁蛋白不仅在造血过程中起着重要作用，而且在抗感染中也发挥着重要作用细胞Fe(铁)。转铁蛋白可用于细菌感染所致黄疸的诊断。由于细菌感染和严重疾病，转铁蛋白的数量会减少。

因此，作为敏感生物化学转铁蛋白是反映新生儿黄疸状况的指标[2］．同时，转铁蛋白的检测可以反馈糖尿病对肾脏的损害，为临床治疗和早期预防提供参考和依据。同时可避免病情恶化，降低临床死亡率[3.］．肝损害与肝脏储备功能细胞下降会影响转铁蛋白的合成和分泌。血清转铁蛋白的降低与肝脏损伤程度有关细胞［4］．因此，对转铁蛋白的研究有助于糖尿病、肾病、缺铁等疾病的诊断和治疗贫血还有病毒性肝炎。报道了血清白蛋白的相关研究。血清白蛋白也可用来测定其作用营养检测。但血清白蛋白在体内的半衰期较转铁蛋白长，且其敏感性较差。因此，对转铁蛋白的研究具有一定的医学意义。

头孢噻肟钠属于β-内酰胺类抗生素，其分子中含有cephams。头孢噻肟钠具有抗菌作用，能破坏细菌细胞壁。头孢噻肟钠对处于繁殖期的细菌有杀灭作用。此外，头孢噻肟钠还具有选择性杀灭细菌的优点低对人体的毒性。因此，头孢噻肟钠作为一种高效、低毒的抗生素，在临床上得到了广泛的应用[5］．头孢噻肟钠的分析方法多种多样。由于其精度高，选择性和灵敏度好，荧光光谱学正被广泛应用于药物分析领域。目前，有关转铁蛋白的分析还不多。转铁蛋白与头孢噻肟钠的结合尚未见报道。采用同步光谱学、紫外吸收等方法研究了头孢噻肟钠与转铁蛋白的相互作用光谱学还有圆二色光谱。对头孢噻肟钠进行分析，可为临床用药提供指导药物动力学分析药物在身体里。头孢噻肟钠分子结构如图所示图1．

实验

装置

同步荧光光谱由岛津RF-5301PC荧光分光光度计记录。用紫外可见记录分光光度计(UV-265，岛津，日本)测量吸收。温度控制采用CS501过热水浴箱(南通科学仪器厂)。pH值测量使用pH - 3c精密酸度计(中国上海莱奇)进行。圆二色谱记录在MOS-450/SFM300圆二色谱仪(Bio-Logic，法国)上。

材料

转铁蛋白购自Sigma-Aldrich(纯度等级低于98%，中国上海)。头孢噻肟钠纯度等级为98.5%。股票转铁蛋白溶液(1.0 × 10⁵M)和头孢噻肟钠(1.0 × 10³M)准备好了。使用含NaCl (0.15 M)的Tris-HCl缓冲溶液使溶液pH保持在7.40，使用NaCl溶液保持溶液的离子强度。所有其他试剂均为分析级，所有水溶液均用双蒸馏水配制，并保存于277 K。

再者，当相互作用时药物用荧光光谱对蛋白质进行了研究药物在蛋白质的激发波长和发射波长处吸收影响荧光强度测定的光。这就是所谓的内过滤效应。为了消除蛋白质和配体的内部过滤效应，在荧光测量的激发波长和发射波长处进行吸光度测量。利用以下关系对激发光的吸收和发射光的再吸收进行了校正，以减少内部滤光片[6]:

(1）

F_天哪和F_{奥林匹克广播服务公司}分别为校正后的荧光强度和实测荧光强度，A_前女友和一个_新兴市场分别为头孢噻肟钠在激发波长和发射波长处的吸光度值。本文中使用的荧光强度已经过校正。

程序

Tris-HCl 0.5 mL (pH=7.40)，转铁蛋白溶液0.5 mL (2.0 × 10⁶M)和不同浓度的头孢噻肟钠依次加入5ml比色管中。样品用双蒸馏水稀释至成比例的体积，摇晃充分混合，并在298 K下静止40分钟。激发和发射狭缝设置为5 nm。当发射波长和激发波长之间的Δλ值固定在15 nm和60 nm时，我们分别用10 mm路径长度的电池扫描了转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的荧光光谱。在310 K和318 K分别重复上述实验。

Tris-HCl 0.5 mL (pH=7.40)，转铁蛋白溶液1 mL (2.0 × 10⁵M)和不同浓度的头孢噻肟钠加入到一系列5ml比色管中。用双蒸馏水稀释至成尺体积，摇匀，静置40 min，以不同浓度头孢噻肟钠溶液为对照品。用10 mm石英在190 ~ 350 nm范围内扫描转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的紫外-可见吸收光谱细胞紫外可见记录分光光度计。

在室温下，用MOS-450/SFM300圆二色谱仪记录头孢噻肟存在时蛋白质二级结构的变化。圆二色实验中，转铁蛋白浓度为1 μM。测量前用99.9%干氮充分清洗分光光度计。对每个光谱进行基线校正，最终图取200 nm至250 nm范围内三个累积图的平均值。圆二色光谱采集间隔为1 nm，扫描速度为100 nm/min。

结果与讨论

转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的同步荧光光谱研究

同步荧光光谱是一种简单有效的方法，可用于测量荧光猝灭和最大发射波长的潜在变化。也能反映发色团周围微环境的变化[7］．同步荧光光谱学通常在蛋白质与小分子相互作用的研究中发挥重要作用。发射波长和激发波长之间的差值(Δλ)固定在15 nm和60 nm。当Δλ=15 nm时，对应的光谱反映了酪氨酸残基的光谱特征。当Δλ=60 nm时，对应的光谱反映了色氨酸残基的光谱特征[8］．图2显示了Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步荧光光谱。如图所示图2，当Δλ=15 nm， Δλ=60 nm时，随着头孢噻肟钠浓度的增加，两个对应的荧光强度均降低，两个光谱峰的位置均发生红移。这一现象表明头孢噻肟钠猝灭了转铁蛋白的荧光[9]，酪氨酸和色氨酸都参与了反应，转铁蛋白构象发生改变，酪氨酸和色氨酸周围微环境极性增加，疏水性降低。

荧光猝灭机理包括静态猝灭、动态猝灭等。在静态猝灭过程中，荧光分子与猝灭剂反应形成新的无荧光化合物或弱荧光化合物。然而，动态猝灭是由荧光分子与猝灭剂碰撞引起的。为了进一步研究转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的机理，实验得到的数据可以用Stern-Volmer方程进行处理[10]:

（2）

在那里,F₀F分别为不存在猝灭剂和存在猝灭剂时的荧光强度。τ₀没有猝灭剂的荧光的平均寿命是10⁸K s。_sv为Stern-Volmer淬火常数。K_问为淬火速率常数，[L]为淬火剂浓度。基于F的线性拟合图₀/F和[L]， K_问K_sv可以得到转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的值和Stern-Volmer曲线。计算结果见表1．转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的Stern-Volmer曲线如图所示图3．如图所示表1，猝灭常数K_sv随温度的升高而减小，曲线斜率逐渐减小图3．因此，静态淬火可能是主要的淬火方式[11］．同时，所有的K_问大于最大值扩散碰撞速率常数(2 × 10¹⁰米^－1•。因此，该过程为转铁蛋白-头孢噻肟钠体系生成新化合物引起的静态猝灭过程[12］．

表1:转铁蛋白和头孢噻肟钠在不同温度(Δλ= 15,60 nm)下的猝灭反应参数。

基于静态猝灭理论[13]，结合常数K^一个转铁蛋白-头孢噻肟钠体系上的结合位点数n可由式(3)计算:

（3）

[L]和[B]在哪里_t]分别为头孢噻肟钠和转铁蛋白的总浓度。假设括号中的n = 1，曲线log(F₀-F)/F相对于log{[L]-[B ._t) (F₀F - F) /₀}绘制并线性拟合，则n的值可由图的斜率得到。如果得到的n值不等于1，则将其代入括号和log (F₀-F)/F相对于log{[L]-[B ._t) (F₀F - F) /₀}再次被绘制。重复上述过程，直到得到的n与括号中的值相同。根据得到的n，还可以得到结合常数Ka。计算结果如图所示表1．如图所示表1， n在不同温度下均近似等于1，说明转铁蛋白中存在一类与头孢噻肟钠结合的位点。同时，结合常数Ka随着温度的升高而降低，进一步表明淬火是一个静态过程[14］．

紫外/可见吸收光谱分析

紫外可见吸收光谱学方法简单，适用于了解药物疏水性的变化，了解药物与蛋白质复合物的形成[15］．动态猝灭主要由碰撞引起，仅改变荧光分子的激发态，而不改变吸收光谱。由于新化合物的形成，静态猝灭改变了荧光物质的吸收光谱[16］．转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的吸收光谱图4．如图所示图4，随着转铁蛋白溶液中头孢噻肟钠的逐渐加入，212 nm处的峰强度随红移3 nm而减小;结果表明，转铁蛋白与头孢噻肟钠的相互作用导致蛋白质骨架的松动和展开，降低了芳香族氨基酸残基微环境的疏水性[17］．上述现象说明转铁蛋白的吸收光谱变化是由新化合物的生成引起的，该过程为静态猝灭过程。

转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的结合距离分析

福斯特共振能源传递是一种描述机制能源通过非辐射偶极-偶极偶联从一个供体分子转移到另一个受体分子，广泛用于估计供体(蛋白质)和受体(相互作用配体)之间的空间距离，以及研究复杂蛋白质的结构、构象、空间分布和组装[9］．根据Förster的无辐射能源迁移理论[18]，效率能源传递E，临界能量传递距离R0 (E=50%)，与能源捐赠人及能源供体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱之间的重叠积分J可由以下公式计算[19，20.]:

（4）

（5）

(6）

在那里,F₀转铁蛋白的荧光强度。F为转铁蛋白与头孢噻肟钠浓度相同时，整个体系的荧光强度(2 × 10⁷M K)。₂方向因子等于2/3。N为溶剂折射率，水和溶液折射率的平均值(1.336)。Φ为供体在没有受体时的荧光量子产率(0.118)。重叠积分表示阴影部分的面积图5．ε(λ)、F(λ)分别为λ波长下头孢噻肟钠的摩尔吸光度和转铁蛋白的荧光强度。由上式，E, J, R₀， r是可用的。它们在表2．如图所示表2， r小于7 nm。非辐射的概率很高能源可验证转铁蛋白与头孢噻肟钠之间的转移[21］．更大的转铁蛋白-头孢噻肟钠的距离，r比r₀本研究的观察也揭示了药物与蛋白质之间存在静态猝灭机制[22，23］．

表2:参数E, J, r, r₀转铁蛋白和头孢噻肟钠在不同温度下(Δλ= 15,60 nm)的反应。

热力学参数和结合力

热力学参数可用于判断结合力的类型。ΔG(标准免费能源变化)、ΔH(焓变)、ΔS(熵变)可由范霍夫方程[24]:

(7）

（8）

K是结合常数R是气体常数。当温度变化不是很大时，系统的ΔH可以看作是常数。数据结果列在表3．从表3， ΔH<0， ΔS>0表示静电力在相互作用中起主要作用[25］．另外，可以看出该体系是一个自发的分子相互作用，其中ΔS>0和ΔG<0。

表3:转铁蛋白-头孢噻肟钠体系在不同温度(Δλ= 15,60 nm)下的热力学参数。

转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的希尔系数

配体分子在大分子的一个位点上的结合通常会影响其与其他位点上的配体分子的亲和力。这就是所谓的合作绑定。希尔系数提供了一种量化这种效应的方法，并通过以下公式计算[26]:

（9)

式中，Y为结合的饱和分数;K是束缚常数，nH是希尔系数。希尔系数大于1表示正合作。相反，Hill系数小于1表示负合作反应，Hill系数等于1表示非合作反应[27］．

用于荧光测量:

（10）

（11）

其中1/Qm是图1/Q与1/[L]的截距。将同步荧光强度(F)代入上式，逐次计算即可得到Hill系数。希尔系数列在表4．在不同温度下，转铁蛋白与头孢噻肟钠的nH值近似等于1，表明转铁蛋白与头孢噻肟钠之间存在非合作反应。

表4:转铁蛋白-头孢噻肟钠体系在不同温度(Δλ= 15,60 nm)下的希尔系数。

转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的圆二色谱分析

圆二色可用于显示蛋白质的构象变化[28］．图6转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的圆二色性。正如大家所知图6，在211 nm和219 nm附近有两个负特征峰，分别是由于α-螺旋肽键的π-π*和n-π*转移[29］．它们是α-螺旋的特征峰。当转铁蛋白与头孢噻肟钠的浓度比为1:0、1:20和1:30时，负特征峰的强度变弱，但负特征峰的形状和位置都没有变化。因此，α-螺旋结构的松动导致转铁蛋白的荧光猝灭，头孢噻肟钠的存在改变了转铁蛋白的构象。然而，α-螺旋仍然是转铁蛋白的主要结构形式[12］．

结论

在模拟生理条件下，研究了转铁蛋白-头孢噻肟钠体系的相互作用机理。随着温度的升高，结合常数(Ka)降低，荧光通过静态猝灭的方式猝灭。ΔS>0， ΔG<0， ΔH<0表示系统为自发的分子相互作用，静电力是主要的结合力类型。转铁蛋白与头孢噻肟钠的结合距离(r)小于7 nm，表明存在无辐射作用能源转铁蛋白和头孢噻肟钠之间的转移。希尔系数近似等于1暗示了非合作反应。一系列的数据分析可以为了解药物在体内的分布、转运过程和相互作用机制提供信息。同步光谱学具有灵敏度和准确性。同步光谱学还有圆二色性光谱学这表明转铁蛋白的α-螺旋二级结构即构象发生了改变。因此，作为不同的研究方法，它们丰富了关于关联机制的研究方法药物和蛋白质。

确认

本文作者在此感谢中国国家科学基金资助项目(no.;21375032)。

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