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酪氨酸酶抑制和溴酚抗氧化活性的海藻Odonthalia corymbifera

*通信:

栗原市H、教师的渔业科学、北海道大学、Minato,函馆,北海道041 - 8611年,日本,电话:40 + 81 138 5561;传真:40 + 81 138 5561;电子邮件: (电子邮件保护)

文摘

我们的搜索过程中酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂,六溴酚二聚体从甲醇提取纯化的红藻Odonthalia corymbifera。与发现的化合物光谱数据公布。这些溴酚分为对称和非对称二聚体。其中,tetrabrominated二聚体显示比tribrominated的酪氨酸酶抑制更有效。特别是不对称tetrabrominated化合物显示强烈的抑制作用。这些结果表明,溴取代和溴酚羟基的取向是酪氨酸酶抑制效能的重要因素。溴酚也追究抗氧化活动通过使用abt和DPPH自由基清除,CUPRAC和收紧金属减少和铜螯合化验。所有二聚体显示类似的抗氧化活动积极控制检查。对称二聚体显示相对更高的抗氧化活性比不对称。

关键字

溴酚;酪氨酸酶;抑制;抗氧化剂

介绍

海洋藻类,常用的食品在东亚国家(1),也是萜类化合物等生物活性次生代谢产物的重要来源,多酚和卤代化合物2]。红藻的家庭Rhodomelaceace是富含含溴酚具有自由基清除3),酶抑制4- - - - - -8],喂养威慑[9,抗炎10)、细胞保护(11),抗菌12,抗癌13,抗糖尿病14),和抗病毒活性15]。

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)、多酚氧化酶类之一,是黑色素生物合成的关键酶。酶介导monophenols羟基化和氧化o-diphenols黑色素形成的早期步骤与mamalian杀菌作用,果实褐变,虾和蟹变黑(16]。然而,它的过度生产导致色素沉着过度(17]。此外,自由基或活性氧物种(ROS)可能诱发α-melanocyte-stimulating激素(α-MSH)产生异常的色素,比如年龄,雀斑,皮肤老化、黑皮病(18]。许多天然酪氨酸酶抑制剂已报告多酚和脂质(16]。

人体自由基不断产生,导致恶化脂质,蛋白质、酶、DNA和RNA。他们可能会导致许多疾病,如动脉粥样硬化、心血管疾病和致癌作用3]。尽管合成抗氧化剂通常用于防止这些问题,他们的使用是至关重要的有毒和致癌作用19]。自然抗氧化剂没有任何副作用所需的自由基清除活性和抵御氧化损伤(20.]。

在搜索的过程中酪氨酸酶抑制剂和抗氧化,天然溴酚分离从海洋红藻Odonthalia corymbifera (s g .葛美林)Greville(松节藻科)。比较研究了溴苯酚的酪氨酸酶抑制和抗氧化活动。

材料和方法

一般的实验程序

核磁共振光谱被记录在一个力量amx - 500(德国卡尔斯鲁厄)核磁共振质子能谱仪在500 MHz和125 MHz碳(CD₃)₂公司或CD₃OD。字段desorption-MS (FD-MS)光谱被记录在JEOL JMS-T100GCV质谱仪(日本东京)。高效液相色谱法(高效液相色谱)是使用日本岛津公司执行LC-10ATvp装置(日本京都)配备一个二极管阵列检测器日本岛津公司SPD-M10Avp和RP高效液相色谱柱(Mightysil^®RP-18、关东大化工有限公司公司东京、日本)。硅胶(Chromatorex^®日本富士Silysia),反相(RP-18)硅胶(Nacalai Tesque Inc .京都,日本)和交联葡聚糖^®LH-20(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)被用于列色谱法(CC)。薄层色谱法(TLC)是在玻璃板上执行预镀硅胶(60 F254 RP-18 F254默克,达姆施塔特,德国)。薄层色谱斑点可视化在紫外灯或喷洒5% H₂所以₄。蘑菇酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)、2、2´-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)联胺盐(abt), 2, 4, 6-tris (2-pyridyl) -s-triazine (TPTZ),和2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。曲酸是可以从东京化工(日本东京)。Ethylenediamine-N, N, N ', N ' -tetraacetic酸二钠盐(EDTA)可以从Dojindo实验室(熊本、日本)。邻苯二酚和2 (3)-tert-butyl-4-hydroxyanisole和光纯化学工业(BHA)买来kouichi(日本京都)。

藻类物质

海洋红藻。Odonthalia corymbifera(松节藻科)收集在函馆的海岸城市,2016年5月,日本。的物种识别是由作者之一(h .栗原市),h . Mizuta教授(教师的监督渔业科学,北海道大学、日本)和凭证标本存放在我们的实验室。

提取和分离

收集海藻用自来水洗净,切成小块。O。corymbifera(1.8公斤)提取95%甲醇(甲醇)和集中(3天,两次)。提取被划分n己烷,乙酸乙酯(层),n丁醇和水溶性分数。层可溶性分数(19.5 g)o . corymbifera在硅胶色谱仪,RP-18列色谱法和交联葡聚糖LH-20。最终的净化是由制备薄层色谱(展开剂;甲苯/层/醋酸,10:10:1,v / v / v)或RP-18高效液相色谱(筛选了含水甲醇70%)获得的化合物1(10.8毫克),2(4.2毫克),3(6.3毫克),4(10.5毫克),5(3.0毫克),6(1.5毫克)。

酪氨酸酶抑制试验

样品溶液(15µl)添加到50毫米钠磷酸盐缓冲剂(780µl, pH值6.8)在试管,其次是增加0.1毫克/毫升酪氨酸(0.5毫升)作为衬底。酶促反应后开始添加200 U /毫升蘑菇酪氨酸酶解决方案(205µl)。反应的解决方案是在25°C的环境为30分钟和吸光度测量在490海里。曲酸是用作积极控制。的集成电路₅₀值表示为样本浓度可抑制五十酪氨酸酶反应的比例。动力学研究进行了一样酪氨酸酶抑制试验除了反应混合物由不同浓度的酪氨酸在甲醇的缓冲和测试样本。Lineweaver-Burk和迪克森图分析是用来确定类型和抑制剂抑制常数(21]。

DPPH自由基清除实验

测试样品溶液(50μl)在甲醇被添加到40μg /毫升DPPH解决方案(950μl)甲醇在试管和混合。在黑暗中,混合了30分钟,测量吸光度在517海里。儿茶酚和底部钻具组合作为积极的控制。欧共体₅₀值表示为样本浓度可淬火fitty DPPH自由基的比例(22]。

abt自由基清除实验

abt自由基阳离子的解决方案是准备通过增加2.45毫米(最终浓度)在水和过硫酸钾- 7毫米abt保持在黑暗的地方。在试验之前,阳离子的解决方案是用乙醇稀释0.70 734海里的吸光度。测试样品溶液(10μl)添加到abt激进的解决方案(1.0毫升)。混合物在室温下了10分钟,吸光度被记录在734海里。欧共体₅₀值表示为样本浓度可淬火五十abt激进分子的比例(23]。

减少铜抗氧化能力(CUPRAC)测定

测试样品溶液(0.1毫升)添加到预混合的反应混合物CuCl 10毫米₂解决方案(0.25毫升),7.5毫米ethanolic neocuproine解决方案(0.25毫升),和1 M乙酸铵缓冲溶液(0.25毫升,pH值7.0)在每个管。混合物在室温下孵化了30分钟,然后吸光度测量在450海里。ECA0.50 0.50意味着样品浓度与吸光度(A_0.50)[24]。

铁降低抗氧化能力(收紧)测定

每个管包含刚做好的收紧试剂混合300毫米醋酸钠缓冲(750μl, pH值3.6),10毫米TPTZ 40毫米HCl FeCl(75μl)和20毫米₃.6H₂O(75μl)。然后样品溶液(30μl)添加和水(100μl)预拌收紧试剂。混合物在室温下了4分钟,吸光度测量在593海里。ECA0.50意味着样品浓度与吸光度的0.50 (A0.50) [25]。

铜离子螯合试验

铜离子螯合能力评估的方法桑托斯et al。26)与轻微的修改。样品溶液(120μl)是混合了50毫米醋酸钠缓冲(800μl, pH值6.0)。然后,100 mg / l CuSO₄.5H₂O解决方案(120μl), 2毫米邻苯二酚紫的解决方案(34μl)被添加到反应混合物和保持2分钟。混合10分钟,进一步动摇了孵化25°C 10分钟。吸光度测量在632 nm和EDTA-Na2作为积极的控制。欧共体₅₀值表示为样本浓度可以螯合fitty铜的百分比^{2 +}离子(26]。

结果与讨论

已知六溴酚1 - 6被孤立的o . corymbifera并阐明其结构的基础上,女士核磁共振数据(图1)。他们比较认同报告的光谱数据4,9,13,27- - - - - -29日]。这些溴酚分为对称(1和2)和不对称的二聚体(3- - - - - -6)。孤立的研究了溴酚抗氧化和酶抑制等各种活动。

在酪氨酸酶抑制试验、复合6显示最有效的抑制剂(IC50 = 1.0µM)溴酚中检查和积极控制曲酸。其他两个强有力的抑制剂化合物1和2µMµM IC50值5.2和11.0,分别。这些化合物具有两个2 3-dibromo-4 5-dihydroxylbenzyl半个结构。所有的溴酚1- - - - - -6具有儿茶酚一部分表现为铜螯合剂的酪氨酸酶(18]。然而复合6显示弱Cu-chelating效力(表1比化合物)1和2。因此酪氨酸酶抑制由溴酚可能会影响其他Cu-chelation机制不同。Multibrominated蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制活性化合物显示高于monobrominated化合物(30.,31日]。化合物1,2和6也显示对蛋白质酪氨酸激酶抑制活性,细胞毒性对人类具有重要意义癌症细胞(13,32]。因此,两个2 3-dibromo-4 5-dihydroxylbenzyl半个似乎酪氨酸酶抑制的重要结构,与tribrominated相比的。尽管tetrabrominated化合物不对称的原因6显示强烈的抑制作用尚不清楚。这些结果表明,溴溴取代和取向和酚羟基组是酪氨酸酶抑制效能的重要因素。在溴酚调查中,只有化合物1动力学分析是研究非竞争性抑制和K我2.4µM的价值。这表明抑制剂1至少可以绑定其他站点活跃的站点,结合自由酶或es复杂(33,34]像prenylated类黄酮酪氨酸酶抑制剂(18]。

表1:各种activitya孤立的溴酚1 - 6。

自由基清除,减少和金属螯合金属化验是用来确定天然溴酚的抗氧化性能。所有的溴酚研究表明自由基清除属性。化合物1- - - - - -4表现出强大的DPPH自由基清除和电子商务活动₅₀5.0到10.0的值µM5,6表现出相对低活动与电子商务₅₀值大约20.0µM (表1)。自由基清除活性取决于hydrogen-donating能力。许多研究人员(3,35,36)报道,酚羟基数量的增加导致更高的自由基清除活性。然而,在目前的研究中,所有的componds1- - - - - -6拥有相同的四个酚羟基组。这样,溴酚抗氧化能力将影响不仅通过酚羟基的数量也由溴和烷基替换。化合物4和5结构同分异构体,然而,4显示两个强比清除活动5。这种差异将依靠溴原子的不同位置和methoxymethyl集团(1]。另外,不同的活动可能取决于不同的方向昊图公司二羟基组或亚甲基醚桥,也就是说,二羟基组桥的位置元和帕拉在1- - - - - -4,昊图公司和元在5和6。abt化验,清除DPPH的趋势显示出类似的模式分析结果。CUPRAC和收紧化验的还原能力捐赠电子与过渡金属化合物(8]。化合物1 - 6同样表示相对比2或3 -还原能力叔-butyl-4-hydroxyanisole (BHA)和邻苯二酚作为积极的控制。彻底清除结果也支持复合减少能力(37]。化合物1 - 3显示最高的潜力减少溴酚检测由于存在儿茶酚和结构对称(半个2,38]。在铜^{2 +}螯合试验,化合物1 - 4表现出相对较高的铜^{2 +}螯合活性与乙二胺的活动——相似N,N, N ', N '-tetraacetic酸(EDTA)作为一个积极的控制。然而复合5显示最弱的螯合能力。与儿茶酚Phenoliccompound半个可以绑定过渡金属(26]。目前尚不清楚的原因5螯合能力较弱。

结论

本研究揭示了不同机制的可能性,除了Cu-chelation由苯邻二酚基,自然产生的溴酚为酪氨酸酶inhibtion。对称算法和非对称溴酚显示酪氨酸酶抑制和抗氧化活动与积极的控制。间溴苯酚,assymmetric二聚体6和对称的二聚体1和2显示相当强烈的酪氨酸酶抑制。这个海洋藻类的潜力可能应用在医药和化妆品行业。

承认

作者表达谦卑感谢大肠Fukushi博士和y先生的中国人,gc - ms和核磁共振北海道大学农业学院实验室测量和质量核磁共振光谱。

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